兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定.docx
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兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定
兔肌肌酸激酶的分离纯化
及部分性质的测定
实验目的:
通过兔肌肌酸激酶的分离纯化及其酶活性质的测定,进一步熟悉和综合运用各种分离提纯办法,熟练掌握生化实验的基本方法。
进一步掌握酶的分离纯化方法,了解兔肌肌酸激酶的部分酶性质。
实验内容及实验技术:
实验内容:
1.肌酸激酶概况;
2.肌酸激酶的催化机制;
3.肌酸激酶的测活方法一pH比色法;
4.肌酸激酶的分离纯化;
5.肌酸激酶的动力学参数测定;
6.肌酸激酶DTNB修饰反应动力学及酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定。
实验技术:
1.颈动脉放血杀兔子;
2.机械法粉碎动物材料的方法;
3.盐析、等电点沉淀和有机溶剂变性、热变性除杂蛋白;
4.盐浴与冰盐浴盐析目的蛋白肌酸激酶(CK);
5.乙醇分级除杂蛋白和沉淀目的蛋白肌酸激酶;
6.-8C,12000r/m高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白;
7.透析法除残余有机溶剂小分子;
8.凸形梯度洗脱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白CK
9.pH比色法测定酶活性;
10.Aaso光吸收法测定酶浓度;
11.酶的动力学参数(Ka,Vmax)的测定;
12.CK的DTNB修饰反应动力学;
13.酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定;
14.SDS-PAGE®定亚基的分子质量和CK纯度;
15.凝胶层析测定CK分子质量。
实验原理:
肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中,是一个
与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。
肌酸激酶可逆地催化
肌酸与ATP之间的转磷酰基反应:
CK
型(MiMi)。
MM型主要存在于各种肌肉细胞中,
要存在于心肌细胞中,而MiMi型存在于线粒体内膜上。
前3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶。
细胞在线粒体上发生氧化磷酸化,产生ATP。
但动物体内贮存能量的高能物质不是
ATP而是磷酸肌酸。
能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制(creatinephosphaateshuttle)
来完成的,这个机制包含了肌酸激酶的线粒体型和肌肉型两种同工酶。
氧化磷酸化产生的ATP在ATP-ADP转位酶(translocase)的帮助下被直接送到位于线粒体内膜外侧的线粒体型肌酸激酶所在部位(I),线粒体型肌酸激酶将ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上,
变成ADP和高能物质磷酸肌酸(H)。
磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维(myofibrils),
肌原纤维的M-区带上结合了肌肉型肌酸激酶(川),这样,当肌肉收缩时,需要大量的
ATP供给能量,肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为ATP,而反应产生的肌酸再扩散回
线粒体,重新磷酸化(W)。
肌酸激酶同工酶具有重要的生理功能和医学应用价值。
肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。
在催化过程中,该酶的最小功能单位是亚基,亚基在二聚体中独立地起催化作用。
根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构,M型亚基由387个氨基酸残基组成,分子质量为43OOOu
左右,分子内有8个巯基,但无二硫键。
天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。
根据旋光色散研究的结果,这个酶的亚基大约有25%-30%的a-螺旋,15%左右的3
-折叠。
肌酸激酶的纯化方法有许多种,本实验采用的提纯方法为改进的Kuby法。
该酶的测活方法也有许多种,本实验采用的是pH-比色法。
肌酸激酶的测活方法(pH-比色法):
肌酸激酶在催化正向反应时,随着ATP向肌酸上转移磷酰基的同时,生成等摩尔的
H+,其最适pH为7.5-9.0,在此范围内测定H+的生成速度,可以作为酶活力的指标。
本实验采用百里酚蓝作为pH指示剂,在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的
活性,即在597nm波长下,监测吸光度的变化。
在比色皿中酶催化反应生成的H+使溶
液的pH值降低,底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色,吸光度值A597不断降低。
在pH-比色法中,肌酸激酶测活的底物溶液需要新配。
配制方法见试剂部分。
测活时,取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中,加入10』酶溶液,迅速盖盖,混
匀后立即监测597nm处光吸收的变化,每15秒或30秒读一次吸光度值(A597),共读取8个数据点,用A597对时间作图,从图中求出每min吸光度值的变化,即△A597。
并按下式计算酶的比活力(U):
U=1.3A597―VA稀释倍数(mol/(min*mg))
C2b
其中:
1.3为吸光度的变化换算成H+的系数。
Va=1.0ml(底物溶液),
Vb=0.01ml(加入的酶溶液)。
C:
加入酶溶液的浓度。
酶溶液浓度C的测定按其在280nm处的吸光度值来确定,其百分吸光系数为E1%1cm=8.8。
即:
C=如10稀释倍数
8.8
四、试剂:
1.KCI:
0.01mol/L,200ml。
(0.15gKCI加水至200ml)
2.NH4OH:
1.7mmol/L,1000ml。
(取0.12ml浓氨水,加H2O至1000ml)
3.柠檬酸铵:
0.05mol/L,pH9.0,1000ml。
(称12.15g溶于1000mlH2O)
4.Tris-HCl:
0.1mol/L,pH8.0,1000ml。
(称Tris12.1g,取HCl23ml,调pH为8.0,加水至1000ml)
5.NH4CI:
研细,10g。
6.NH40H:
5mol/L,100ml(公用)
7.MgSO4:
2.0mol/L,pH8.5,20ml。
(公用)
8.MgAC2:
0.07mol/L,pH9.0,100ml。
(公用)
9.NaOH:
0.2,0.5,1.0,2.0,5.0(mol/L)。
(公用)
10.HAc:
0.2mol/L。
11.95%CH3CH2OH(乙醇)
12.粗盐
13.底物溶液的配制:
通常一次配制20ml,当天使用。
配制方法:
取10ml48mmol/L的肌酸溶液,加入1.0mlO.1mol/L的MgAC2,2.0ml0.1%的百里酚蓝(称100mg百里酚蓝,加20ml乙醇溶解后再加水60ml),1.0ml0.1mol/LpH9.0的Gly-NaOH缓冲液,称48mgATP溶于此溶液,再补加水5.0ml,用0.1〜0.2mol/LNaOH仔细调此溶液的颜色为深紫红色(吸光度为1.8〜2.2)即可。
五、实验步骤:
(一)、兔肌肌酸激酶的分离纯化:
1.将兔子化冻后取大腿肌50g,去除结缔组织和神经后剪碎。
加200ml0.01mol/LKCl,
用组织打碎机(或食品加工机)和高速分散器各粉碎3次以上,每次不超过30s,以防过热。
2.冰浴搅拌提取15-30min,用8000r/min,0C,离心10min,弃去沉淀,测上清体积为W,取样0.5ml。
V1=81.0ml。
3.在其余上清中加入研细的NH4CI至浓度为0.1mol/L(逐滴加入)。
加入的NH4CI的量:
Mnh4ci=5.35XV1=0.431g。
用5moI/LNH4OH调pH至9.0(最适pH值),冰浴搅拌30min(0C)。
4.加入1.5倍V1体积的95%冷乙醇,20C搅拌2.5h。
以热变性法用60%的有机溶剂变性除杂蛋白。
1.5V1=121.50mI
—8C,8000r/min离心10min。
弃沉淀,测上清液体积为V2,取样0.5ml。
V2=155.5ml
5.其余上清液中加入Vaml的2mol/LMgSO4(pH=8.5),至终浓度为0.03moI/L。
VA2
A0.03,VA=2.37mI
VaV2
1.5VA=3.55mI
再补加1.5VA体积的95%冷乙醇,逐滴加入,搅拌30min,—8C,8000r/min离
心10min,弃去上清。
6.沉淀加1/10V1体积的MgAc2(0.07moI/L,pH=9.0)溶解悬浮(冰浴)。
冰浴搅拌1h
后,0C,12000r/min离心10min,弃去沉淀,测上清体积为V3,取样0.5ml。
V3=13.2ml
7.其余上清液用0.5-1mol/LNaOH调pH=8.0。
置冰盐浴内缓慢加入Vb体积的95%的
冷乙醇至终浓度为36%。
VB的计算式:
(V3-MgAC2的加入量厂0.6+V0.36
V3+Vb
本实验中:
VB=2.64ml。
8.搅拌30min后,—8C,12000r/min离心10min,弃去沉淀,测上清体积为V,取样0.5ml。
V4=14.5ml.
9.其余上清置于冰盐浴中,缓慢加入Vc体积的95%的冷乙醇至终浓度为50%。
Vc的计算式:
乂°.36+%=0.5
V4+Vc
本实验中Vc=4.06ml。
10.搅拌30min后,—8C,12000r/min,离心10min,弃上清,沉淀溶于4mlpH9.0
0.05mol/L的柠檬酸铵溶液,即为V5,取样0.2ml。
(以NH4OH调pH值)
V5=4.6ml.
11.对此缓冲液透析过夜。
透析袋内加液量控制在1/2到1/3左右,最外面加上冰浴,
每小时换一次缓冲液,4-5h。
12.再对1.7mmol/L的NH4OH透析,0C,12000r/min离心10min,弃去沉淀,测上清体积为V6,取样0.5ml。
V6=4.5ml.
13.其余的V6溶液用此NH4OH透析液调蛋白的质量浓度约为5g/L后用恒流泵上样至
DEAE-52离子交换层析柱,用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl平衡缓冲液洗至基线平。
将上样时未被吸附液和冲洗前阶段液体收集,得穿过峰体积,即为V8。
取样
0.5ml。
14.用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶,收集活性峰(峰管测活),合并得到V7样品,
取样0.5ml,其余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。
离子交换柱层析:
取约10mL湿的DE-52阴离子交换纤维素,抽干后在0.5mol/LNaCl-NaOH
溶液中浸泡30min,水洗至中性,在0.5mol/LHCl中浸泡30min,水洗至中性,
在0.5mol/LNaOH中浸泡30min,水洗至中性抽干,然后再用0.01mol/LpH8.0
Tris-HCI平衡缓冲液浸泡过夜。
在本次实验中,我们使用的柱子是做过一次兔肌肌酸激酶分离的旧柱子,所
以直接用50ml1moI/LNaCI上泵洗柱,再用0.01mol/LpH8.0Tris-HCI平衡缓冲液平衡。
最终柱高约4cm。
凸形梯度洗脱液体系:
Ci(混合瓶):
0.01mol/L,pH8.0,Tris-HCl,50ml,(瓶塞不漏气);C2(贮液瓶):
0.10mol/L,pH8.0,Tris-HCl,150ml;洗脱速度:
0.2-0.3ml/min;收集体积:
2-3ml/管/10-15min。
从上样开始收集,洗脱完毕,逐管测定A280。
选择A280较大的管测活,绘制洗脱图。
凸形梯度洗脱用在此处的优点:
在前几十管分离杂蛋白时,盐梯度增长很快,
而后几十管洗脱兔肌肌酸激酶时,盐梯度变化缓慢,有利于该酶与杂蛋白的分离。
洗脱后逐管测电导,画出凸形梯度洗脱曲线,并换算出该酶洗脱下来时相应的Tris-HCl缓冲液的盐浓度。
(二)、峰管与分离过程中各级分测活:
1.确定合适的稀释倍数,使所得吸光度值在可测范围之内;
2.用微量可见塑料杯,取测酶活底物1.0ml,加入10卩l已稀释好的酶样品溶液,
盖盖摇匀后测A597(15s读一次数),画图计算△A597;
3.计算酶的比活力U。
(三)、SDS-PAGE检测分离纯度:
1.样品处理:
将冰干的待检测样(V与V8)用0.01MTris-HCl溶解,取20卩l溶解的样品,加入20卩l样品处理液后沸水浴煮沸5min。
样品最终浓度约为1mg/ml,吸光度A280约为1。
2.灌胶
3.上样:
第3孔上",第7、第9孔上V8。
上样量:
20卩l/孔。
4.加电解槽液在外侧,至高玻璃下。
5.稳压100V电泳,至溴酚蓝到距下沿1cm处。
6.停止电泳。
7.以考马斯亮蓝染色2h,脱色过夜。
六、数据记录及处理:
1.洗脱图及洗脱曲线的测定(表1):
表1洗脱数据
口
吕号
A28Onm
电导率(S/cm)
口
吕号
A280nm
电导率(iS/cm)
1
0.006
440
28
0.017
510
2
0.007
29
0.020
530
3
0.049
160
30
0.018
650
4
0.115
31
0.020
740
5
0.094
32
0.021
750
6
0.027
310
33
0.023
740
7
0.010
34
0.028
770
8
0.008
360
35
0.115
990
9
0.011
36
0.213
1210
10
0.013
390
37
0.217
1450
11
0.033
580
38
0.168
1530
12
0.035
39
0.134
1920
13
0.056
40
0.092
1710
14
0.251
41
0.061
790
15
0.418
42
0.054
2750
16
0.553
43
0.037
2850
17
0.667
44
0.033
2810
18
0.589
45
0.033
3100
19
0.297
46
0.033
3290
20
0.140
47
0.036
3290
21
0.079
720
48
0.036
3330
22
0.043
580
49
0.045
3460
23
0.027
530
50
0.053
3350
24
51
0.062
3310
25
0.021
510
52
0.060
3530
26
0.022
610
53
0.047
3730
27
0.018
510
54
0.040
3890
说明:
测量中第24管自动部分收集器发生跳管,即24管中没有接到任何液体;
在开始收集时,由于流速太慢,每管接收不到1ml,所以电导率的测定只有合
并几管进行。
由于疏忽,将第13管到第20管在测完吸光度时就合并了,导致了无法逐管测量其电导率。
电导率的数据变化异常。
洗脱图(图1):
洗脱图
图1洗脱图
14-20管为穿过峰,合并得V8;
34-40管为活性峰,合并得V7。
凸形洗脱曲线图(图2):
线曲化变率导电
10203040
管数
图2凸形洗脱曲线图
2.峰管酶活测定(表2):
表2活性峰管酶活测定
口
吕号
A597nm(每隔15秒读一数)
14
1.555
1.392
1.233
1.083
0.944
0.820
0.711
0.618
15
1.330
1.043
0.798
0.607
0.472
0.384
0.327
0.290
16
1.229
0.890
0.629
0.456
0.354
0.296
0.261
0.238
17
1.126
0.696
0.441
0.321
0.265
0.236
0.219
0.208
18
1.247
0.932
0.675
0.495
0.383
0.317
0.276
0.250
19
1.310
1.108
0.924
0.763
0.631
0.526
0.447
0.387
20
1.533
1.479
1.426
1.373
1.321
1.270
1.220
1.171
20(稀释2倍)
1.462
1.424
1.387
1.350
1.314
1.278
1.242
1.208
20(稀释5倍)
1.478
1.468
1.457
1.446
1.436
1.427
1.419
1.140
34
1.382
1.322
1.264
1.206
1.149
1.095
1.043
0.993
35
0.968
0.886
0.812
0.743
0.681
0.629
0.573
0.528
36
0.397
0.363
0.334
0.310
0.289
0.272
0.256
0.243
37
0.828
0.765
0.710
0.654
0.603
0.559
0.522
0.486
38
0.925
0.880
0.837
0.795
0.755
0.717
0.682
0.648
39
0.846
0.826
0.805
0.779
0.753
0.731
0.714
0.697
40
0.873
0.856
0.837
0.820
0.805
0.789
0.772
0.753
51
0.674
0.671
0.667
0.663
0.660
0.656
0.653
0.650
52
0.799
0.798
0.795
0.790
0.788
0.786
0.781
0.776
说明:
由于第51、52管的吸光度比周围管稍高一点,所以也被选出测酶活,检测其活性。
第14管测活
Tl第14管测
活曲线
线性(第
14管测活
曲线)
图3第14管的A597
1555_0618
计算:
第14管:
As9^1.555"535
1.75
第15管测活
♦第15管
测活曲线
线性
(第15管
测活曲线——
第15管的A597-1(线性不好,选前4点重新拟合检查其线性)。
第15管测活
1.5
T一第15管测
活曲线
——线性(第
15管测活曲线)
0.5
1530
4560
时间/s
图5第15管的A597-2
计算:
第15管A597=1.3300607=0.964
0.75
第16管测活
T一第16管
测活曲线
线性
(第16管测活曲线)
图6第16管的A597-1(线性不好,选前4点重新拟合检查其线性)。
第16管测活
图7第16管的A597-2
1229-0456
计算:
第16管:
■:
A597=0456=1.031
0.75
第17管测活
时间/s
图8第17管的A597-1(线性不好,选前3点重新拟合检查其线性)。
第17管测活
图9第17管的A597-2
1126—0441
计算:
第17管:
:
.A597=0441=1.370
0.5
第18管测活
时间/S
第18管测活曲线
——线性(第
18管测活曲线)
图10第18管的A597-1(线性不好,选前4点重新拟合检查其线性)。
第18管测活
图11第18管的A597-2
1247—0495
计算:
第18管.■■■:
A597二0.495=1.003
0.75
第19管测活
图12第19管的A597-1(线性不好,选前4点重新拟合检查其线性)。
第19管测活
线性(第
19管测活曲线)
图13第19管的A597-2
计算:
第19管•A97二13100763=0.729
0.75
第20管测活
153045607590105120
时间/s
图14第20管的A597
1533_1171计算:
第20管.叭97」门八=0.207
1.75
第34管测活
图15第34管的A597
1382—0993
计算:
第34管.:
A59^1^820993=0.222
1.75
第35管测活
图16第35管的A597
计算:
第35管:
A59^°^0528=0.251
1.75
0397—0243
计算:
第36管.A97二一=0.088
计算:
第37管.:
乓97二08280486=0.195
1.75
第38管测活
图19第38管的A597
计算:
第38管.%97=0.925一0.648=0.158
1.75
第39管测活
图20第39管的A597
计算:
第39管.扁’084^"085
第40管测活
图21第40管的A597
计算:
第40管.a97=0.8710.753=0.068
1.75
第51管测活
mnvAyx
图22第51管的A597
计算:
第51管.如二067^650“014
第52管测活
第52管测活曲线
——线性(第
52管测活曲线)
图23第52管的A597
0799-0776
计算:
第52管.A—0"990.776=o.oi3
1.75
各峰管活性及浓度计算:
计算公式:
比活力(U):
U=1.3一—A597一x稀释倍数(mol/(min*mg))
C5
加入酶溶液的浓度(C):
C=A28°°°乂稀释数
8.8
表3活性峰酶溶液的浓度及比活力
口
吕号
△A597nm
浓度C
比活力U
口
吕号
△A597nm
浓度C
比活力U
14
0.535
0.285
244.04
35
0.251
0.131
249.08
15
0.964
0.475
263.83
36
0.088
0.242
47.27
16
1.031
0.628
213.42
37
0.195
0.247
102.63
17
1.370
0.758
234.96
38
0.158
0.191
107.54
18
1.003
0.669
194.90
39
0.085
0.152
72.70
19
0.729
0.338
280.38
40
0.068
0.105
84.19
20
0.207
0.159
169.25
51
0.014
0.070
26.00
34
0.222
0.032
903.04
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- 肌酸激酶 分离 纯化 部分 性质 测定