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农药分子设计研究课题副本
基于麦长管蚜的海藻糖酶抑制剂的合理设计与筛选研究
摘要
随着农业现代化的进步,人工合成有机杀虫剂来防治病虫害已成为提高农作物产量的主要手段之一。
为解决传统化学杀虫剂所带来的毒性残留、害虫抗药性等负面问题,新型无公害绿色农药的研发已成为重要的研究领域,农业生物技术的发展,特别是化学信息学的出现和农药分子设计的应用,为这一研究提供了前所未有的机遇。
近年来,针对昆虫生理过程中特有的一些能源物质如海藻糖、几丁质、生长激素等,来确定新的药物作用靶点,已成为农药研发的新途径。
分布在中国各产麦区。
麦长管蚜寄主于小麦、大麦、燕麦,前期集中在叶正面或背面,后期集中在穗上刺吸汁液,致受害株生长缓慢,分蘖减少,千粒重下降,是麦类作物重要害虫。
也是麦蚜中的优势种。
本文旨在提出以害虫麦长管蚜为对象,利用计算机辅助的合理设计和筛选一种海藻糖酶抑制剂。
关键词:
海藻糖酶抑制剂计算机辅助农药分子设计靶标先导化合物
第一章文献综述
1.1引言
昆虫是地球上种类最为繁盛的一个类群,昆虫的血糖,它不同于哺乳动物体内的葡萄糖和植物中的蔗糖而是选择了海藻糖作为其血糖。
海藻糖的性质非常稳定,能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜,有效地保护生物分子结构不被破坏,从而能有效维持生命体的生命过程和生物特征。
而在自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类,均不具备这一功能。
对许多生命体而言,海藻糖的有与无,意味着生存或者死亡[1]。
海藻糖,广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及其它无脊椎动物中,既是一种贮藏性糖类,又是应激代谢的重要产物。
因此,以海藻糖为靶标的除虫剂对人和动物是十分安全的。
昆虫飞行是一个极大的耗能过程。
有研究表明,在飞行的起始半个小时,主要消耗的是碳水化合物——海藻糖,而在昆虫持续飞行的过程中血淋巴中脂肪的含量会随飞行时间的增加而明显降低。
这种特殊的能量代谢途径的存在,为昆虫飞行抑制剂的研发提供了思路[2]。
近年的研究已经发现validamycinA(VLA),t-rehazolin,salbostatin等筛选于微生物体内的小分子化合物,可以抑制昆虫体内海藻糖的水解过程。
通过抑制海藻糖水解为葡萄糖,从而引发昆虫“低血糖症”,己经可以达到杀灭害虫的效果。
海藻糖合成酶的结构已知,可以以此进行基于受体的农药分子设计,但由于海藻糖水解酶晶体结构仍然未知,给海藻糖酶抑制剂的研究带来困难。
目前所研究的天然海藻糖酶抑制剂虽然具有较高的离体活性,但是难以进入生物体内,难以作为生物农药推广。
以这些抑制剂为先导化合物,通过先导优化、分子模仿等方法合成出一些具有相同或相近功效的新型杀虫剂和杀菌剂将是开发海藻糖酶抑制剂类农药的主要方向[3]。
计算机辅助药物设计(Computer-aideddrugdesign,CADD)方法的快速发展也是合理药物设计取得重大突破的一个重要原因。
CADD以计算机技术为基础,利用理论模拟、计算和预测等手段分析配体小分子与受体大分子之间的相互作用机制,以此来指导新药结构的设计过程。
目前,许多国家的药物研发者和制药公司也将CADD技术作为药物结构设计的重要手段,且在该领域的研究成果也显示了CADD的巨大实用价值。
1.2海藻糖酶的研究现状
1.2.1海藻糖酶的特性
海藻糖水解酶,国际酶学编号为(EC:
3.2.1.28),首先是在1893年由Bourquelot在黑曲霉中发现的,广泛存在于微生物、植物、昆虫和哺乳动物中。
海藻糖酶由海藻糖酶基因Trehalas编码,以两种不同形式存在于昆虫组织中,一种是可溶型海藻糖酶Tre-1;另一种是膜结合型海藻糖酶Tre-2。
Tre-1是1992年最先在黄粉虫Tenebriomolitor中被克隆出来的第一个由海藻糖酶基因编码的海藻糖酶,主要存在于消化系统和循环系统中,在肠道、马氏管、卵巢和唾液腺等部位表达。
遗传学研究发现蝉中肠可溶型海藻糖酶与卵巢膜结合型海藻糖酶来自同1个遗传子;于彩虹[4]等(2013)研究发现亚洲玉米螟O.furnacalis等幼虫随着日龄的增加,海藻糖酶活性呈现增加趋势,不同昆虫各组织海藻糖酶的活性有明显差异;这项研究为我国开展农业害虫海藻糖酶方面的研究提供基础数据。
Tre-2是2005年在家蚕Bombyxmori中获得的第一个海藻糖酶基因编码的海藻糖酶,主要存在于肌肉中。
在飞行肌肉相关组织、肠道、马氏管、脂肪体、脑组织、卵巢和唾液腺中都有表达。
该基因包含一个20个氨基酸的跨膜区域,而Tre-1则不存在跨膜区。
最近,陈静等(2013)等利用同源克隆及RACE技术,从白背飞虱Sogatellafurcifera、绿盲蝽Apolyguslucorum中克隆获得膜结合型海藻糖酶基因,为研究其在昆虫体内的表达与生物学功能奠定了良好基础。
目前已在多种昆虫中克隆获得这两种海藻糖酶基因,它们所编码的蛋白具有2个“标签序列”PGGRFREFYYWDSY和QWDYPNAWPP及一个甘氨酸富集区(GGGGEY)[5]海藻糖酶是昆虫体内重要的糖酶,存在于昆虫几乎所有的组织中,海藻糖酶把1分子的海藻糖水解为2分子的葡萄糖,用于组织细胞的糖酵解,为各组织器官提供能量,使昆虫的各项生命活动得以维持和发展。
1.2.2海藻糖酶在昆虫中的作用
1.2.2.1海藻糖酶对昆虫能量代谢的调控作用
早在20世纪60年代,张清刚(1964)[6]在研究蓖麻蚕变态期间代谢作用时就发现血淋巴和脂肪体中糖代谢与海藻糖酶活力变化之间存在一定的联系。
近年来很多研究表明大量昆虫飞行、肌肉剧烈运动所需的能量由能源物质海藻糖和糖原代谢产生,当海藻糖酶活性受到抑制时,海藻糖酶催化海藻糖分解的过程也会受到抑制,昆虫的各种能量供应及血糖的浓度都会受到制约。
还有研究表明一些杀虫剂亚致死剂量能够增强褐飞虱体内海藻糖酶活性,有效促进海藻糖的降解。
相反,冈霉亚基胺A井冈霉素A及海藻唑啉(Trehalose)等能够有效抑制海藻糖酶的活性,致使以海藻糖为能源物质的能量供应受到抑制。
1.2.2.2海藻糖酶在昆虫几丁质合成中的调控作用
海藻糖酶还能抑制昆虫几丁质的合成,进而影响昆虫的生长发育。
Tre-1对于昆虫表皮中几丁质的合成、碳水化合物的摄取以及体内营养的动态平衡具有重要意义,对昆虫表皮的几丁质合成影响更大;Tre-2则主要影响中肠的几丁质合
成以及生长发育过程。
Chen[7]等揭示了两种不同类型海藻糖酶对甜菜夜蛾生长发育过程中几丁质合成功能的影响,当用Tre-1的RNA感染片段干扰后,昆虫几丁质合成酶A基因的表达和幼虫表皮几丁质的含量受到显著影响,表现为影响甜菜夜蛾幼虫到蛹的蜕皮变态;而Tre-2则在蛹到成虫的发育阶段中具有重要作用,主要表现为影响几丁质合成酶B基因的表达和幼虫中肠几丁质含量。
魏苹[8]对赤拟谷盗Triboliumcastaneum的5个海藻糖酶基因进行单个基因的RNA干扰后,发现大量基因表达下降,TcTre1-1通过调节几丁质的合成通路对其生长进行调控,其他4个基因都是通过调节能量通路对其发挥作用。
由此可见,海藻糖酶是昆虫表皮几丁质合成通路中一个重要的酶。
1.2.2.3海藻糖酶在昆虫滞育中的作用
海藻糖酶是昆虫滞育激素调控代谢过程中的关键酶,昆虫滞育期间海藻糖酶活性的下降保证了海藻糖在昆虫体内的累积,使其安全度过滞育期的不良环境。
家蚕海藻糖酶基因是一种非组织特异性表达基因,可以在卵巢、中肠、马氏管和脂肪体等多种组织中表达,其表达受滞育激素(DH)的诱导调控,DH通过心侧体、咽侧体释放到血淋巴中,诱导卵巢中海藻糖酶基因的表达,家蚕卵母细胞通过位于膜内的海藻糖酶,将血液中海藻糖降解成葡萄糖,然后吸收到细胞内,最后合成糖原,从而诱导蚕卵滞育,而在其他组织中滞育激素对海藻糖酶的活性没有影响。
随后,种种研究都表明,海藻糖酶对昆虫的滞育过程具有重要的作用[9]。
此外,海藻糖酶活性受抑制后,会影响昆虫生殖腺和生殖细胞的发育,因此昆虫的生殖能力也会被抑制,还会导致昆虫变态时的异常;研究还发现增强家蚕膜结合型海藻糖酶的活性能够有效促进滞育激素诱导卵巢产生滞育卵,利于提高抗寒性。
1.3海藻糖酶抑制剂研究进展
随着农业现代化的进步,人工合成有机杀虫剂来防治病虫害己成为提高农作物产量的主要手段之一。
然而,随着各类杀虫剂不断投入使用,也带来了诸如农药残留、害虫抗药性等负面问题,特别是在《寂静的春天》一书出版之后,农药的安全性问题引起了人们更多的关注。
为解决这些问题,新型杀虫药剂的研发已成为众多农药研究工作者所追求的目标。
治标还需治本,从昆虫本身寻找其必需的基因,作为农药作用的靶点,然后展开农药研发是一条可行的杀虫途径。
这种新型杀虫剂不仅可以最大限度地控制病虫害,而且还可以保证生态平衡不受到破坏,减轻对人类及其他非靶标生物的毒害等。
近年来,许多化学家致力于研发基于海藻糖酶抑制剂的新型农药,试图通过阻断有机体内海藻糖的合成或者分解代谢,来达到杀虫和抑菌的目的。
海藻糖酶作为新型农药开发的靶标,为海藻糖酶抑制剂的开发提供了基础。
从1970年链霉菌中分离到井冈霉素A(ValidamycinA,VLA),并将其作为水稻纹枯病防治剂使用以来,已从微生物以及植物细胞中分离得到了多种海藻糖酶抑制剂,在这些天然小分子结构的基础上,通过生物电子等排、活性基团组合等农药分子设计方法,又不断地人工合成了许多新型抑制剂。
如,井冈霉素A(ValidamycinA,VLA)、井冈霉亚基胺A(ValidoxylamineA,VAA)、Trehazolin、Salbostatin、MDL25637、Deoxynojirimycin和Castanospermine等[10],部分化学结构式如下图所示。
在发挥作用的过程中这些化合物多以其糖苷配基基团对海藻糖酶的抑制作用为基础,通过与海藻糖酶活性位点上的氨基酸(Glu、Ala等)相互作用形成复合物,然后竞争性地抑制海藻糖的水解。
海藻糖在海藻糖酶的作用下水解包括以下几个过程:
1.酶识别(或氢键识别),即海藻糖所含的羟基与海藻糖酶的活性位点通过氢键进行结合;2.海藻糖环上的氧形成氧碳翁离子;3.酶所含的羧基与氧碳翁离子通过“静电作用”络合;4.桥头键在水分子的作用下断裂。
井冈霉亚基胺A由井冈霉素A、C、D、E、F的共同糖苷组成,为水溶性多羟基、弱碱性化合物,分子式为Cl4H25NO8,相对分子量为335.35。
井冈霉亚基胺A与海藻糖酶的底物海藻糖结构十分相似,对海藻糖酶具有很强的亲和力,是通过争夺海藻糖与海藻糖酶的结合位点来实现抑制作用的,是海藻糖的竞争性抑制剂。
其作用过程主要是:
1.氢键识别,由于井冈霉亚基胺A与海藻糖具有类似的化学结构,它所含的羟基也可以与酶活性位点形成氢键;2.井冈霉亚基胺A所含的氮质子化;3.酶所含的羧基与质子化的氮通过强静电作用络合[11]。
井冈霉亚基胺A对海藻糖酶的抑制活性很高,但它是多羟基的水溶性化合物,很难直接穿透昆虫体壁到达“酶靶标”,只有通过“注射”用药,强行使其到达“酶靶标”,才能表现出杀虫效果。
所以,对井冈霉亚基胺A这一先导化合物进行结构模拟,来合成出近似功效的新型杀虫剂是新农药开发的新目标。
井冈霉素A是由一分子葡萄糖和一分子井冈霉亚基胺A通过β2糖苷键连接构成的。
对于离体海藻糖酶,井冈霉素A抑制能力要明显低于其水解产物井冈霉亚基胺A。
但是井冈霉素A能迅速地进入细菌细胞质中,抑制胞内海藻糖酶的活性,尽管离体酶抑制活性降低了几十倍,但其活体杀菌效果却提高近百倍,成为目前最为广泛使用的生物农药。
Trehazolin是小单抱菌属菌株的一种代谢产物,也是一种假二糖抑制剂,具有很高的海藻糖酶抑制活性,对昆虫、哺乳动物和微生物等海藻糖酶的IC50值在10-8至10-9mol/L水平上。
Wegener等给蝗虫成虫体内注射10微克Trehazolin,24h后血淋巴中葡萄糖含量下降90%、海藻糖含量增加一倍。
虽然Trehazolin对离体海藻糖酶有很强的抑制活性,但是由于结构中含有太多羟基而无法进入昆虫体内,和井冈霉亚基胺A一样没有活体杀虫活性。
人们先后发现ValidoxylamineA,Salbostatin和Trehazolin等虽然具有很高的离体海藻糖酶抑制活性,但是其活体效果却很差,并不能很好的到达酶靶标。
为此,人们对天然海藻糖酶抑制剂的结构进行了不断优化,但是仍停留在局部结构的“微调”阶段,尚无结构简单且具有实际农药意义的有效品种开发成功。
对于海藻糖酶抑制剂的筛选不但要解决昆虫体壁穿透性差、残效期过长或过短等不足,还应该考虑其对其他生物及人类健康所造成的不利影响,使其更好地为农业生产服务。
1.4计算机辅助药物设计
农药的发展经历了从传统的随机筛选到基于某一作用靶标的生物合理农药分子设计,这些技术的发展都是在确信关于农药分子与受体相互作用中存在着一条普遍规律而进行的。
现如今,采用各种理论计算方法和分子图形模拟技术,在计算机辅助下进行农药分子设计己经成为当前国际上农药研究中最为前沿的领域。
对于受体三级结构未知的情况,就需要用间接农药分子设计。
也就是以小分子的构效关系为基础,从一组小分子化合物的结构和生物活性数据出发,使用一些计算机方法对药效团进行识别,以抽提共同的药效基团,进而反推受体的模型以指导新型杀虫药剂的研发。
这一方法己被最近几年的研究工作所认可,而且更是通过新型农药化合物的成功实例得以证实。
三维结构已知的受体分子,可采用同源模建其受体的分子结构,来寻找新农药的作用靶标。
这几种虚拟的农药筛选方法,可以大大减少工作量与成本,加快创新农药研发的步伐。
以下是所立课题的技术路线:
生物活性测试
基于海藻糖合成酶结构的农药设计
昆虫海藻糖合成酶蛋白序列的选择
蛋白序列的同源比对
基于药效团模型的农药设计
已有海藻糖水解酶抑制剂的研究
药效团构象的建立
同源模建,结构预测
分子叠合
底物与模型相互作用模型的建立
分子对接
基于药效团的数据库搜索
新型先导化合物的筛选
海藻糖酶抑制剂的合成
全新高效海藻糖酶抑制剂先导化合物
海藻糖酶的分离与纯化
1.5研究意义
新型杀虫剂的研究旨在发现、开发一种安全高效的新品种,并最大限度地提高作物产量及确保对公众的健康。
总体来说,当今农药研究开发的趋势主要集中在以下几个方面:
继续研究开发生物合理性的、低剂量的杀虫剂;大力研发天然的杀虫剂和以天然产物为先导化合物的、作用机理独特的新型药剂;生物农药和基因工程作物的研究将更加广泛;对昆虫生长调节剂及昆虫代谢机理的研究将更加深入。
由于威胁人类健康的疾病及虫害的不断衍生,害虫的抗药性也随着农药靶标分子的缺乏而逐渐增强,毫无疑问,更多的科学挑战仍将继续。
由于到目前为止,还没有商品化的海藻糖酶抑制剂类农药品种,本课题将在已研究的基础上,针对发展还很不成熟的海藻糖酶抑制剂提出合理的设计方法,有利于海藻糖酶抑制剂的发展和创新,同时也可以改善当前一些农药造成的对非靶标物和环境造成的危害。
第二章新型海藻糖合成酶抑制剂先导化合物的筛选研究
2.1前言
在药物分子设计中,基于受体的合理药物设计占有极其重要的地位。
先导化合物的筛选方法分为两种,一种为随机筛选,也称为高通量筛选,是以大量的化合物为基础,进行广泛的生物活性测试,从中找出具有研发价值的先导化合物,这种筛选方法带有一定的随机性与盲目性,且耗资、耗时、耗力,效率低。
另一种方法一般来说,是在通过X-单晶衍射技术或多维NMR获得受体生物大分子结合部位的结构后,就可以采用分子模拟软件分析结合部位的结构性质,特别是静电场、疏水场、氢键作用位点等分布信息,然后再运用数据库搜寻或运用全新药物分子设计技术,识别得到分子形状和理化性质与受体作用位点相匹配的分子结构,合成并测试这些分子的生物活性。
经过几轮循环,可发现新的先导化合物。
这种筛选方法具有更强的针对性和目的性,可以减少药物研发过程中的人力和资金浪费,降低新药的研发成本,缩短新药的开发周期。
目前基于受体结构的药物设计可分为两大类:
一类是根据受体活性位置来构建配体,也就是全新药物设计(denovodrugdesign);另一类是以受体结构来搜寻配体,也就是分子对接(moleculardocking)
利用计算机的强大运算功能,根据某个靶点的相关性质,利用分子对接或三维药效团搜索等方法在各种化合物库中寻找可能与靶标有较好相互作用的潜在活性化合物分子,向提供这些化合物的公司购买或自己合成这些分子后,进行相应的药理活性测试。
与传统的实体化合物高通量蹄选技术相比,虚拟蹄选能更快地对大型化合物库进行搜索,高效地命中分子,且不存在样品的限制,其成本远低于高通量蹄选,拥有很好的性价比。
针对昆虫代谢过程中主要的供能物质——海藻糖,从以下五个步骤展开对昆虫飞行抑制剂的筛选工作。
1)分析现有关于海藻糖合成酶的序列信息及实验方法,对昆虫体内的海藻糖合成酶展开进化分析,寻找突破点;
2)对现有的海藻糖合成酶序列信息进行同源性分析,模建其三维结构,寻找昆虫体内海藻糖合成酶的活性位点。
针对其活性位点,进行分子对接,动力学优化等:
3)在上述工作的基础上,进行小分子先导化合物的筛选;
5)进行环境友好测试,以评价其毒性及致突变性。
2.2海藻糖酶抑制剂的虚拟筛选
2.2.1昆虫海藻糖合成酶蛋白序列的选择
海藻糖合成酶广泛分布于细菌,真菌等多个物种,由于哺乳动物不能自行合成海藻糖,因此机体内也不存在这一糖苷合成酶。
通过搜索蛋白质保守区域数据库,也可以发现,海藻糖合成酶在进化过程具有一定程度的保守性,来源于不同物种的海藻糖合成酶,蛋白同源性很高[12]。
方法:
以小分子的构效关系为基础,从一组小分子化合物的结构和生物活性数据出发,使用计算机方法对药效团进行识别,以抽提共同的药效基团,进而反推受体的模型。
2.2.2同源序列比对
使用基于序列和结构相似性的FUGUE比对程序,找到一段同源的蛋白结构。
并确认其是一个可信的蛋白模板。
2.2.3蛋白的同源模建
蛋白虚拟结构的建立,采用AccelrysDiscoveryStudio软件包来完成。
根据序列对比结果,将蛋白分为海藻糖磷酸合成酶功能区(A)和海藻糖磷酸酶功能区(B)两个结构区域,再进行模拟筛选较为合适的蛋白构型。
模拟结束时,即产生许多个虚拟结构。
利用AccelrysDiscoveryStudio/homology的profile_3D/verify模块来计算模板与我们模建的结构是否兼容。
假如氨基酸的CompatibilityScore为负数时,则可能是结构有误的区域。
另外,依照结构的大小计算整个蛋白的预期的总数,假如总数低于最小值,则表示此结构是不正确的结构。
2.2.4底物CG4104-PA(A)与模型相互作用模型的建立
由于该底物在昆虫体内的主要功能是作为海藻糖合成过程中的糖苷酶。
而在同源模建过程中我们选1GZ5作为CG4104-PA(A)的模板,因此通过分析1GZ5与其配体的相互作用,我们就可以大体得知,模建后的蛋白在昆虫体内的活动情况。
2.2.5活性位点的搜素与基于受体-配体相互作用的分子对接的展开
Sybyl7.0/SitelD模块可以用来确定在生物大分子靶点内部或表面上潜在的结合位点,通过两种模式来识别受体与配体的潜在结合部位,一种模式是溶剂化受体结构表面来定位溶剂球趋向聚集的区域从而快速识别蛋白质空腔;另一种模式是通过对分子表格进行详细地分析来识别可能的活性位点。
分别利用两种方法,搜索虚拟蛋白的活性位点,基于上述受体模型的活性位点氨基酸分布情况,我们就可以基本确定其与配体分子的相互作用情况,然后展开基于受体-配体相互作用的分子对接并对其结果利用Surflex-Dock和FlexX-Pharmconstraints进行虚拟筛选。
第三章海藻糖水解酶抑制剂的设计、合成与生物活性测定
3.1前言
传统的药物分子结构设计是基于化合物的结构与生物活性之间的关系,根据各基团在静电场和立体场中所做的贡献,选择出可能使化合物生物活性提高的官能团,药效团模型和QSAR方法就是基于这种理论来进行化合物的结构设计。
该方法在早期的药物研究中起到了重要的作用。
本章主要通过分析已知的海藻糖水解酶抑制剂的分子结构,确定药效团,使筛选一个全新、有效的化合物成为可能。
基于Gasp模块,寻找到了一系列配体结构中与受体作用密切的关键官能团,从而完成新型先导化合物设计。
3.2海藻糖酶抑制剂的设计
3.2.1药效团构象的建立
先导化合物活性构象的确定是工作开展的第一步。
利用文献搜索,我们已找到多种小分子抑制剂。
首先使用Chemoffice8.3构建从文献报道中获取的Salbostatin、Validoxylamine、Trehazolin、Deoxynijirimyein等四个小分子先导化合物,利用分子力学的方法优化四个小分子的结构,确定分子的低能构象。
使用三维分子模拟软件Sybyl7.0,将以上四种小分子的结构信息以MOL2的格式输入,并用Maximin2分子力学方法再次优化分子能量和构象,确保分子构象的能量最优。
将建立完毕的分子存入数据库。
3.2.2分子叠合
随后基于Sybyl软件包中的Gasp(GeneticAlgorithmSimilarityProgram)模块,判断一系列配体结构中与受体作用密切的关键官能团。
3.2.3基于药效团的数据库搜索
基于Gasp建立的模型,使用数据库检索模块Unity,展开基于药效团的柔性三维结构数据库搜索。
作为Sybyl中的一个重要工具,Unity包含两个重要的模块:
UnityBase和Unity3D。
其中Unity3D提供最基本的基于二维结构的检索功能。
使用Unity3D,选择LQSample数据库,展开基于已定义的活性官能团特征的三维结构检索。
3.3海藻糖酶抑制剂的合成与测定
3.3.1合成
利用有机合成的方法,选择经济的原料合成目标产物,并对目标产物分子进行红外光谱测试,核磁共振以及质谱分析,确定产物结构与目标产物结构一致。
3.3.2海藻糖酶的分离纯化
目前,已经从昆虫、哺乳动物、微生物和植物等分离得到了海藻糖酶,其中昆虫来源的海藻糖酶研究最多。
由于分离方法的限制,早期分离海藻糖酶一般采用比较简单的分级沉淀方法。
1957年,Kalf等[13]通过30%硫酸铵沉淀、加热、40%~70%硫酸铵分级沉淀和丙酮沉淀等方法从蜡螟的幼虫中分离得到海藻糖酶,纯化倍数达到了114倍。
目前报道的海藻糖酶的分离纯化大多采用硫酸铵分级沉淀、凝胶层析、疏水层析和离子交换层析等常规的分离技术。
Lee等[14]以蜜蜂为来源分离得到海藻糖酶,酶液先经过硫酸铵沉淀,再分别经过DEAE-SepharoseCL-6B、CM-SepharoseCL-6B、Butyl-toyo-pearl650M、DEAE-SepharoseCL-6B和p-Aminophe-nylB-glucoside-sepharose4B等柱层析分离,酶的纯化倍数达到5380倍,总收率高达7711%,是目前报道的纯化倍数最高的海藻糖酶。
根据酶与底物、底物结构类似物、辅助因子和抑制剂等的特异亲和力,可使用亲和层析技术,采用较少的分离步骤取得较好的分离效果。
Valaitis等[15]分别采用两种不同的方法分离舞毒蛾中肠的海藻糖酶,采用亲和层析技术,从盐析处理的粗酶液出发,以海藻糖为配基,利用海藻糖酶能与海藻糖特异性结合的能力,亲和层析纯化海藻糖酶,再经过凝胶电泳,酶的纯化倍数可达到609倍,比另一种常规层析分离方法的效果好得多。
3.3.3生物活性检测
海藻糖酶抑制剂的生物活性通过测定抑制剂作用前后,害虫提取液中海藻糖酶活性的变化而测得
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