SDS-PAGE--非还原性non-reduced和还原性等Word文件下载.docx
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所以不能断开二硫键。
DTT:
还原剂,可以断开二硫键。
有些蛋白天然活性结构是二聚体或三聚体,如果加入β-巯基乙醇,它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键,这样,电泳的样品将会被完全还原成单体形式,不加的样品中则会保持聚体的形式,这时候样品在凝胶中的位置就会处于其2倍或3倍分子量的位置了。
2.SDS-PAGE有非还原性(non-reduced)SDS-PAGE和还原性(reduced)SDS-PAGE之分,均是变性条件下的电泳。
还原与非还原的区别是在样品处理时加或不加还原剂(如DTT或2-巯基乙醇等)。
非变性(non-denaturing)PAGE又称为天然(native)PAGE,操作的基本过程与SDS-PAGE相似,唯一不同的是在实验过程中尽可能保持蛋白质的天然完整性,包括避免使用任何还原剂、缓冲液中避免使用变性剂(如SDS)、样品的预处理以及电泳过程应在低温下进行等。
3.我现在经过多方面咨询,问了几个海龟和公司的技术顾问,已经搞明白了,就是这个抗体针对的位点含有二硫键,所以所有的western试剂中都不能含有还原剂(如DTT,巯基乙醇等,包括裂解液和上样缓冲液,有些裂解液如果是买公司的,可能公司会加入还原剂)。
因为还原剂会打开二硫键而变成巯基。
所以抗体就不识别了。
蛋白的样品处理方法有3种:
还原SDS处理,带有烷基化作用的SDS处理,非还原SDS处理。
还原SDS处理:
是常规的SDS—PAGE,在上样缓冲液中加入还原剂,DTT等,打开二硫键,SDS打开非共价键,所以使蛋白还原变性为椭圆形单体。
带有烷基化作用的SDS处理:
烷基可以永久并且牢固的保护巯基,维持单体形成,防止蛋白再次形成二硫键的空间结构。
非还原SDS处理:
样品中只加入SDS,而不加DTT还原剂,此时二硫键不能断裂,所以蛋白没有完全去折叠。
保持这一定的4级结构。
非还原SDS处理因为二硫键的连接,可能会有几条多肽链连在一起,所以最后的分子量要比预期的大,可能是2倍或3倍。
因为我的目的条带已经100KD了,如果有多聚体,那么会200-300KD大小的蛋白,转起膜来还不累死我啊。
所以我已经换抗体了,换了个多抗,常规条件就可以做,方便多了,况且做WB的话,多抗完全可以。
哈哈,已经打电话给晶美换了。
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- SDS PAGE 原性 non reduced
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