抗病毒生防菌F01菌株发酵条件优化毕业论文Word文档格式.docx
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蓝藻是地球上最早出现的光合自养生物,在长期的演化过程中形成了广泛的适应性。
从蓝藻中分离具有不同生物活性的次级代谢产物,并以此为先导化合物进行新药物开发,已引起药学工作者极大的关注。
TMV是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的代表种。
该属病毒为正义单链RNA(positiveSENSEsingle-strandedRNA,+ssRNA)病毒,病毒复制时正链基因组RNA首先复制出负链RNA(negmivesenseRNA,.RNA),再以负链RNA为模版产生正链基因组及亚基因组RNA。
病毒粒子为刚直的长杆状,长300hm,直径18nm,螺旋对称结构,有2130个蛋白亚基以右手螺旋排列,螺距为2.3nm,负染色后在电镜下中央轴槽清晰可见。
1.3抗病毒活性成分
植物病毒是危害农作物的一类重要病原,因其危害大、防治困难,俗有植物癌症之称。
由于植物病毒对植物细胞的绝对寄生性,病毒复制所需要的物质、能量场所等完全由寄主提供,病毒能够胁迫寄主细胞的生化机理,使其与病毒本身的生化机理纠缠在一起难以识别,所以药物难以只对病毒进行选择性攻击而不伤害寄主细胞,导致研究高选择性的化学抗病毒制剂面临极大的困难,至今仍未取得重大突破。
对烟草花叶病(TobaccoMosaicVirus,简称TMV)的防治,国内外已做了大量的研究,特剃是在植物抗病毒基因研究上取得了一系列进展,但是由于远缘杂交的不亲和性,使由抗性基因转移翡难度很大。
其次,农业栽培措施壶于受耕作制度和社会经济发展的限制,在生产中有效的实施仍有一定难度,使用化学或生物制剂防治烟草花叶病不失为一种经济有效的措施。
现有的药剂菌奇演、宁南霉素、病毒A、病毒必克有一定防效(防效大多在30,.-60%),但药剂防治效果还不理想。
植物病毒病是影响农业生产的重要因素之一,全世界每年因植物病毒病害所造成的产量损失大约占粮食总产量的10%(Fraser,1985)。
有效地控制病毒的为害是农业生产上的当务之急。
迄今为止,几乎没有能有效地从感染病毒的植物上除去病毒的化学药剂。
有些化学药剂(如嘌呤、嘧啶类似物)能减缓病毒的增殖,但无根除之效,而且常常比病毒更易伤害作物。
近年来,植物源抗病毒制剂(生物源农药)由于其高效、低毒、无残留的特点和优势,在植物病毒病害防治过程中发挥出越来越重要的作用。
自1925年Duggur等从商陆(phytolacca)上发现第一个植物病毒抑制物以来[14],陆续开发了很多抗病毒制剂,像病毒A、植病灵、金叶宝等。
目前研究发现的抗病毒活性物质,既有生物小分子的次生代谢产物,也有大分子的多糖、核酸和蛋白质等。
其中蛋白质类活性物质广泛存在于自然界各种生物体内,包括植物、微生物、动物等,最受关注,同时也是研究较多的一类活性物质。
动物病毒广泛侵袭各类动物,对经济动物也不例外,在家禽家畜养殖中屡见不鲜。
在如今的抗动物病毒活性成分化合物中,主要都是黄酮类相关的化合物。
黄酮类化合物泛指具有15个碳原子(C6-C3一C6)的多元酚化合物,广泛存在于自然界中。
按结构可分为黄酮和黄酮醇类、双黄酮类、二氢黄酮及二氢黄酮醇类、查耳酮类、异黄酮类以及其它黄酮类等。
许多中草药的抗病毒活性成分都是黄酮类化合物,如从甘草中分离出的黄酮类成分甘草素与异甘草素有很强的抑制艾滋病病毒(HIV)能力,甘草香豆素属于异黄酮类的衍生物,甘草吡喃香豆素等多种甘草黄酮类成分可抑制H1V诱导的巨细胞形成,且未见细胞毒性。
自从1993年首次从短叶红豆杉的韧皮部分分离到一株产紫杉醇的内生真菌后,研究者就开始不断地从内生菌中分离出各种活性代谢产物⋯,这其中就包括抗病毒活性代谢产物。
目前临床上常用的药物主要有如下几种:
抗流感病毒及呼吸道病毒药物:
抗疱疹病毒药物:
抗巨细胞病毒药物;
抗肝炎病毒药物:
抗人类免疫缺陷病毒药物。
抗病毒药物的治疗已有近30年的历史,由于病毒进入机体后,模仿宿主的生化机理在宿主细胞内进行复制和繁殖,因此,能抑制病毒繁殖的药物对宿主细胞或机体有不同程度的损害,使得抗病毒药的发展与抗生素相比较为缓慢。
到目前为止,尚无令人完全满意的抗病毒药。
1.4目的意义
在农药的投入上,生物农药的比重越来越小,工业化生产出的化学农药却逐年增加。
但是化学农药的大量使用和长期延续,已给人类带来了不利的影响,它不仅严重破坏了人们赖以生存的自然环境,影响了正常的生态循环,还危及到人类的健康。
如土壤的严重板结和酸化,既造成农药浪费,又破坏土壤结构,降低农作物产量和品质;
还会污染水源,造成江河湖泊水华现象和海洋赤潮;
而水的负营养化,对水生动植物的生存造成极大的威胁:
地下水与地表水的污染,使农作物的品质下降,严重影响到人类的生存与健康。
尽量减少化学农药的使用成为现代农业生产中人们所十分关心的问题。
因此如何研究出高效,高质,高优的化学产品,减少化学药品的使用量,采用生物农药,生物防治至关重要。
从而在未来的抗病毒,抗真菌,细菌的舞台上,更多的需要依靠生物菌来防治病害,病毒等,这其中最主要的就是放线菌。
放线菌在自然界的分布极为广泛,存在于各种不同的自然生态环境里,其种类繁多,代谢功能各异,是一类有着广泛实际用途的生物资源。
放线菌所产生的抗生素能有效地防治人类和牲畜的多种传染性疾病。
目前人们在生物体内发现的6000多种抗生素中,约60%来自放线菌,其中包括许多在医药上有重要作用的抗生素,因而成为近代抗生素等制药工业的最重要的微生物资源之一。
微生物发酵的生产水平最基本的是取决于生产菌种的性能,但有了优良的菌种之后,还需要有最佳的环境条件即发酵工艺加以配合,才能使其生产能力充分表现出来。
因此必须研究生产菌种的最佳发酵工艺条件,如营养要求、培养温度、pH条件、对氧的需求等,据此设计出合理的发酵工艺,使生产菌种处于最佳的产物合成条件,进而取得优质高产的效果。
本实验采用抗病毒生防菌F-01菌株,以高氏一号培养基为基础,作为菌株碳氮源及实验环境条件的筛选准则,采取单因素变化,采用梯度实验初步确定最优原料比例和条件。
实验过程中,分别用各种单糖代替2%的淀粉选出较优碳源,同理用氮源代替0.1%硝酸钾选出较优碳源,然后用较优碳源和氮源进行正交实验,得到最优碳源,氮源。
利用最优碳源,氮源对培养条件进行优化实验。
最终得出最适合F-01生长的发酵条件。
第1章材料和方法
2.1实验菌株
F-02菌株;
F-07菌株;
F-12菌株;
F-ZH菌株。
(实验室保存菌株)
2.2实验仪器及试剂
2.2.1实验仪器
精密电子天平,立式电热压力蒸汽灭菌器,数显酸度计,净化工作台,移液枪,锥形瓶,研钵,恒温培养箱,摇床,量筒,冰箱
2.2.2实验试剂
淀粉,果糖,麦芽糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,玉米粉,小米粉,大米粉,黄豆粉,蛋白胨,大豆蛋白胨,酪蛋白胨,硝酸钾,硫酸铵,K2HPO4,MgSO4·
7H2O;
NaCl;
FeSO4·
氯化钾,TMV病毒液。
2.3培养基
放线菌培养基(高氏1号培养基):
淀粉(2g)
KNO3(0.1g)
K2HPO4(0.05g)
MgSO4.7H2O(0.05g)
NaCl(0.05g)
FeSO4.7H2O(0.001g)
水100mL
2.4实验方法
2.4.1菌株培养方法:
以高氏一号培养基为菌株提供生长环境,采用统一规格的锥形瓶(250mL),由于实验过程中才用碳源十种(淀粉,果糖,麦芽糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,玉米粉,小米粉,大米粉,黄豆粉),氮源五种(蛋白胨,大豆蛋白胨,酪蛋白胨,硝酸钾,硫酸铵),在做碳源筛选的时候,分别用所选碳源代替高氏一号中的碳源淀粉;
同理,在做氮源的时候,用所选氮源代替高氏一号培养基中的氮源硝酸钾。
用精准天平分别称取高氏一号培养基中所需试剂分量,称取完毕后,分别加入100ml的蒸馏水,并将其密封,将培养基放入灭菌框中在立体式电热压力蒸汽灭菌器中灭菌30分钟(120℃),灭菌完成后,取出灭菌后的培养基,冷却至室温,在超净工作台里将菌株接种培养基中并密封,将接种的培养基放在摇床(28℃,180rpm)环境下培养7天,7天后取出培养基,在超净工作台中,用移液枪从培养基中取菌液于2ml离心管中,菌液培养完成。
2.4.2TMV病毒液制作:
取症状明显感染TMV病毒的烟草叶片,并称取其质量,将病毒叶放入研钵中,加入少量的石英砂和PBS(PhosphateBufferedSaline
)进行研磨,研磨大概30分钟,按照1g病毒叶配100mLpbs配置病毒液,完成后再加入适量的石英砂(有利于在接种的时候损伤叶片,从而更好的使烟草叶片感染TMV),完成后将病毒液放入冰箱保存。
PBS(PhosphateBufferedSaline)PBS1L配方pH7.4:
磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g,磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g,氯化钠(NaCl)8.0g,氯化钾(KCl)0.2g,加水至1000mL。
2.4.3ELISA:
酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay):
ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。
即:
用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被:
用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μgml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。
次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
(简称洗涤,下同)。
2. 加样:
加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体:
于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
4. 加底物液显色:
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
5. 终止反应:
于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定:
可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:
反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。
也可测O·
D值:
在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·
D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
2.4.4半叶枯斑法:
挑选健康且长势一致的心叶烟,将事先提取的TMV病毒液混匀,并取出适量病毒液,采用摩擦接种的方法,将TMV病毒液接种到心叶烟的叶片上,由于接种损伤叶片,因此接种后叶片会有短暂的萎焉现象,将其放置3-4小时,即待叶片基本恢复正常状态,用毛笔将菌液均匀的涂在接种TMV病毒叶片的左半部分,每种菌液设置重复2-3次,菌液涂抹完成,做好标签,涂上菌液后4-5天统计结果,分别统计叶片左右的病斑数,并算出抑制率,可得出菌液的效果,通过活性得较优碳源,氮源组分。
抑制率=(对照枯斑数一处理枯斑数)对照枯斑数×
100%
第2章培养基优化
3.1菌株优化
3.1.1菌株培养基:
以高氏一号培养基为基础,所选碳源麦芽糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,果糖代替原培养基中的2%淀粉,制作培养基,通过高温灭菌,冷却至常温,并接种F-02菌株;
F-ZH菌株四种菌株在摇床(28℃,180rpm)中培养七天。
3.1.2活性测定:
取出各个培养基中的对应菌液,以半叶枯斑法,采用健康,长势基本一样的心叶烟做活性测定。
3.1.3结果及分析
单糖
重复
2#菌株
平均抑制率%
重复1
重复2
左
右
抑制率%
麦芽糖
28
37
24
30
20
22
甘露糖
12
21
43
15
26
42
半乳糖
14
31
55
10
25
60
57
葡萄糖
29
36
19
16
06
果糖
8
58
27
56
7#菌株
7
13
5
6
9
4
73
47
44
63
53
12#菌株
33
2
3
62
41
50
40
17
08
ZH菌株
18
32
03
通过五种不同的碳源培养基对4种菌株抗病毒活性测定的结果可以看出,F-02,F-07两种菌株的效果较好。
3.2碳源优化
3.2.1菌株培养基:
以高氏一号培养基为基础,所选碳源麦芽糖,甘露糖,果糖。
葡萄糖,半乳糖,淀粉,黄豆粉,大米粉,小米粉,玉米粉。
代替原培养基中的2%淀粉,制作培养基,通过高温灭菌,冷却至常温,并接种F-02菌株;
F-07菌株2种菌株在摇床(28℃,180rpm)中培养七天。
淀粉
52
9.5
玉米粉
38.5
小米粉
11
大米粉
黄豆粉
23
11.5
75
30.5
通过对十种碳源的实验结果数据分析可得较优碳源四种:
果糖,淀粉,小米粉,玉米粉。
3.3氮源优化
3.3.1菌株培养基:
以高氏一号培养基为基础,,所选氮源:
硝酸钾,硫酸铵,大豆蛋白胨,蛋白胨,酪蛋白胨。
代替原培养基中的0.1%硝酸钾,制作培养基,通过高温灭菌,冷却至常温,并接种F-02菌株;
3.3.2活性测定:
3.3.3结果及分析
氮源
硝酸钾
硫酸铵
蛋白胨
38
大豆蛋白胨
酪蛋白胨
48.5
39
39.5
53.5
71
59
54.5
通过对五种氮源的实验结果数据分析可得较优碳源三种:
硝酸钾,大豆蛋白胨,酪蛋白胨。
3.4碳氮源组合优化
3.4.1菌株培养基:
以高氏一号培养基为基础。
所选碳源:
果糖,淀粉,小米粉,玉米粉;
所选氮源:
两两组合制作培养基,通过高温灭菌,冷却至常温,并接种F-02菌株;
碳氮源组合表
碳源
果糖
果糖硝酸钾
淀粉硝酸钾
小米粉硝酸钾
玉米粉硝酸钾
果糖大豆蛋白胨
淀粉大豆蛋白胨
小米粉大豆蛋白胨
玉米粉大豆蛋白胨
果糖酪蛋白胨
淀粉酪蛋白胨
小米粉酪蛋白胨
玉米粉酪蛋白胨
3.4.2活性测定:
3.4.3结果及分析
正交
重复3
淀钾
35
淀豆
淀酪
45
果钾
果豆
34
果酪
玉钾
1
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