生物技术综合试验终稿文档格式.doc
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微量移液器、微量离心管(又称Eppendorf管)、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计
2.材料:
含有质粒的大肠杆菌DH5a
3.试剂及溶液:
LB培养基、葡萄糖
质粒小提试剂盒
操作步骤
1.质粒DNA的提取
1)培养细菌:
将带有质粒的单菌落,接种到LB液体培养基中,37oC,200r/min,过夜震荡培养;
2)柱平衡步骤:
向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。
(请使用当天处理过的柱子)
3)取过夜培养的细菌培养液3mL于Eppendorf管中,转速12000r/min离心1min,去掉上清夜,用滤纸吸干;
4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1(确保已加入RNaseA),用枪头混匀;
5)向离心管中加入250μl溶液P2,温和上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
6)向离心管中加入350μl溶液P3,立即温和上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。
12000rpm离心10分钟,此时在离心管底部形成沉淀。
7)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)尽量不要吸出沉淀。
12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
8)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW(加入无水乙醇),12000rmp离心30-60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CP3放入收集管中,,12000rmp离心2分钟,目的是将吸附柱中的残留的漂洗液去除。
11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB,温室放置2分钟,12000rmp离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。
2.用分光光度计测定质粒DNA的浓度
五、问题讨论
(1)提取质粒DNA有多种方法,所有这些方法都包括3个基本步骤:
培养细胞使质粒扩增;
收集和裂解细菌;
分离和纯化质粒DNA。
可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁,SDS(十二烷基硫酸钠)可使细胞壁裂解。
经溶菌酶和SDS处理后,在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性,而当加入乙酸钾在中性条件下,巨大的染色体DNA分子难以复性,而质粒DNA很快得以复性,离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来,而质粒DNA则留在上清夜中,用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤,可得到质粒DNA。
(2)利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法,是定量DNA、RNA常用且快速的方法。
组成核酸的五种碱基(G,A,T,C,U)均在260nm处有强吸收峰,正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。
碱基的种类不同,最大吸收波长以及吸光系数不同,即使是相同碱基,也会随pH的变化,吸光系数也会产生变化,一般在中性附近进行测定。
采用本法能够对纯度较好的核酸进行准确定量,对纯度不高的样品,因为糖和蛋白质均具有紫外吸收,常会产生定量不准的结果。
另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收,在定量时需注意,特别是苯酚有很强的吸收,用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。
核酸样品在260nm和280nm波长下均有一定的光吸收值。
如果比较纯的核酸样品,其OD260/OD280是固定的,对DNA样品而言其值大约为1.8-2.2,如高于2.2则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染,因此可用测定样品OD260/OD280的方法来分析核酸样品的纯度。
六、试验结果
计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度和纯度。
实验二、双酶切反应
一、实验目的
1.掌握双酶切反应的基本原理
2.掌握双酶切反应获得质粒载体的基本方法
二、实验原理
DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:
Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅱ类由两种酶组成:
一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;
另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列。
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。
如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
三、实验材料及试剂
实验材料:
实验一获得的PET28a质粒载体
实验试剂:
EcoRI、XhoI、10xHbuffer、灭菌水、冰、37℃水浴
四、双酶切反应体系(20μL)
Hbuffer(10x)
2μL
1μL
EcoRI
0.5μL
XhoI
DNA
4μL
5μL
ddH2O
12μL
3μL
Total
20μL
10μL
五、实验步骤
1)将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪按照体积由大到小的顺序加入上述溶液,再加入重蒸水使总体积为18μl。
2)将管内溶液混匀后加入2μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加,漏加。
使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。
3)混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。
4)每管加入2μl0.1mol/LEDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
注:
将加好的反应体系放入37℃恒温水浴锅中反应。
如果是载体,则反映时间为5~6h,如果是DNA则反应时间是1~2h。
附:
(A)
(B)
(C)
BamHI
HindⅢ
1xK
1xm
1.掌握琼脂糖凝胶的制备方法
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法
3.掌握DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用
根据DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
电泳过程中或电泳完毕,直接利用低浓度的荧光染料EB(溴化乙锭)进行染色,EB可以嵌入核酸双链的配对碱基当中,在紫外激发下,发出荧光,即可确定DNA条带在凝胶中的位置而且灵敏度很高,少知1~10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。
不同浓度的琼脂糖凝胶的分离范围
凝胶中的琼脂糖含量(%)
线状DNA分子的有效分离范围(Kb)
0.3
5~60
0.6
1~20
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7.0
1.2
0.4~6.0
1.5
0.2~3.0
2.0
0.1~2.0
琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶试剂盒回收酶切产物。
试剂盒中有一个特制的Column,将硅胶填制到这个特制的管中,利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA,在低盐和高PH的条件下DNA可以再次被洗脱的原理,进行DNA的回收和纯化。
三、主要实验仪器和试剂
主要仪器:
电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。
主要实验试剂:
1、50×
TAE(2MTris,1M醋酸,50mMEDTA(pH8.0))
2、10×
上样缓冲液(loadingbuffer)
3、分子量标准DNAMarker
4、琼脂糖
5、EB(溴化乙锭)(黑暗保存)
6、DNA回收纯化试剂盒(AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒)
四、实验步骤
琼脂糖凝胶的制备:
1、将洗净的电泳槽洗净,置于平整的台面上,并调节水平;
2、用1×
TAE电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖,微波炉加热使其溶解;
3、待琼脂糖溶液冷却至60°
C左右时,缓缓将琼脂糖倒入胶模中,厚度约5至7mm;
4、插入梳子,静待琼脂糖凝固;
5、将胶模放进电泳槽中,向电泳槽倒入1×
TAE电泳缓冲液,没过胶约5mm;
6、小心拔掉梳子,用20ul移液器吸取DNA溶液(20ulDNA加2~3ul10×
loadingbuffer),缓缓加入点样孔;
并在最右边的点样孔加6ulDNAMaker;
7、接通电源,(注意电源的正负极!
)电泳至条带前缘到达胶的2/3左右,约20~30分钟;
8、电泳完毕,关闭电源。
从胶模中取出琼脂糖凝胶,放入EB染色液中,染色6-8min,然后置于紫外灯下观察。
酶切产物凝胶回收:
1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,计算凝胶重量。
(100mg凝胶,计100ul体积)(尽量缩短暴露UV灯下的时间!
)
2、加入3个凝胶体积的BufferDE-A(600ul),混合均匀后,于65°
C加热,直至凝胶完全熔化。
3、加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B(300ul),混合均匀,当分离的DNA片段小于400bp时,加入1个凝胶体积的异丙醇。
4、吸取3中的混合液,转移到DNA制备管(置于2ml离心管中),12000r/min离心1min,弃滤液。
5、将制备管置回2ml离心管中,加500ulBufferW1,12000r/min离心30sec,弃滤液。
6、将制备管置回2ml离心管中,加700ulBufferW2,12000r/min离心30sec,弃滤液。
重复一次。
7、将制备管置回2ml离心管中,12000r/min离心1min。
彻底去除残余的液体。
8、将制备管置于1.5ml离心管中,在制备膜中央,加25~30ul65°
CEluent或去离子水,室温静置1min。
12000r/min离心1min洗脱DNA。
五、思考题:
1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率?
2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响?
掌握引物设计的方法和原理
二、实验步骤
1、在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用PrimerPremier5搜索引物
①打开PrimerPremier5,点击File-New-DNAsequence,出现输入序列窗口,Copy目的序列在输入框内(选择As),此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer,进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项,点击Search按钮,进入引物搜索框,选择“PCRprimers”,“Pairs”,设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在SearchParameters里面,可以设定相应参数。
一般若无特殊需要,参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化,因为100~200bp的产物电泳跑得较散,所以可以选择300~500bp.
③点击OK,软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,会自动跳出结果窗口,搜索结果默认按照评分(Rating)排序,点击其中任一个搜索结果,可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况,包括上游引物和下游引物的序列和位置,引物的各种信息等。
④对于引物的序列,可以简单查看一下,避免出现下列情况:
3’不要出现连续的3个碱基相连的情况,比如GGG或CCC,否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括:
Tm应该在55~70度之间,GC%应该在45%~55%间,上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多,大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色,表示存在该二级结构,点击该红色按钮,即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物,应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽,比如引物存在错配的话,可以就具体情况考察该错配的效率如何,是否会明显影响产物。
对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成,Oligo自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.
⑤在Primer5窗口中,若觉得某一对引物合适,可以在搜索结果窗口中,点击该引物,然后在菜单栏,选择File-Print-Currentpair,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pdf文档,里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面,File菜单下,选择Open,定位到目的cDNA序列(在primer中,该序列已经被保存为Seq文件),会跳出来两个窗口,分别为InternalStability(DeltaG)窗口和Tm窗口。
在Tm窗口中,点击最左下角的按钮,会出来引物定位对话框,输入候选的上游引物序列位置(Primer5已经给出)即可,而引物长度可以通过点击Change-Currentoligolength来改变。
定位后,点击Tm窗口的Upper按钮,确定上游引物,同样方法定位下游引物位置,点击Lower按钮,确定下游引物。
引物确定后,即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
②Analyze中,第一项为Keyinfo,点击Selectedprimers,会给出两条引物的概括性信息,其中包括引物的Tm值,此值Oligo是采用nearestneighbormethod计算,会比Primer5中引物的Tm值略高,此窗口中还给出引物的DeltaG和3’端的DeltaG.3’端的DeltaG过高,会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小一些,最好不要超过9。
③Analyze中第二项为DuplexFormation,即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况,还可以选择Upper/Lower,即上下游引物之间的二聚体形成情况。
引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素,因此应该避免设计的引物存在二聚体,至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的,即其DeltaG值应该偏低,一般不要使其超过4.5kcal/mol,结合碱基对不要超过3个。
Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和DeltaG值。
④Analyze中第三项为HairpinFormation,即发夹结构分析。
可以选择上游或者下游引物,同样,DeltaG值不要超过4.5kcal/mol,碱基对不要超过3个。
Analyze中第四项为CompositionandTm,会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。
上下游引物的GC%需要控制在40%~60%,而且上下游引物之间的GC%不要相差太大。
Tm值共有3个,分别采用三种方法计算出来,包括nearestneighbormethod、%GCmethod和2(A+T)+4(G+C)method,最后一种应该是Primer5所采用的方法,Tm值可以控制在50~70度之间。
第五项为FalsePrimingSites,即错误引发位点,在Primer5中虽然也有Falsepriming分析,但不如oligo详细,并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率,一般的原则要使误引发效率在100以下,当然有时候正确位点的引发效率很高的话,比如达到400~500,错误引发效率超过100幅度若不大的话,也可以接受。
⑤Analyze中,有参考价值的最后一项是“PCR”,在此窗口中,是基于此对引物的PCR反应Summary,并且给出了此反应的最佳退火温度,另外,提供了对于此对引物的简短评价。
若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在,并且DeltaG值偏大的话,Oligo在最后的评价中会注明,若没有注明此项,表明二级结构能值较小,基本可以接受。
⑥引物评价完毕后,可以选择File-Print,打印为PDF文件保存,文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息,多达数页。
因此,打印前最好关掉Tm窗口和DeltaG窗口,可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口(若存在可疑的异常的话)和PCR窗口。
4、引物确定后,对于上游和下游引物分别进行Blast分析,一般来说,多少都会找到一些其他基因的同源序列,此时,可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析,只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。
三、注意事项:
1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。
引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。
3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。
不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。
4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5.尽可能使用两条引物的Tm值相同(最好相差不要超过5℃),退火温度根据较低的Tm值选定,也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。
引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。
Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。
6.ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。
引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
9.引物序列应该都是写成5-3方向的,Tm之间的差异最好控制在2度之内。
10.密码子的简并,如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
实验五、聚合酶链式反应(PCR)
一.实验目的
1.学习并掌握PCR基因扩增的操作方法
2.理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性
二.实验原理
设计出一对寡聚核苷酸引物可与目的DNA分子互补,以至于能被DNA聚合酶相向延伸,那么被该引物结合的摸板区就可通过变性、退火和聚合的循环来大量扩增,这一过程被称为聚合酶链式反应。
该技术1985年由Mullis及同事们设计并研究成功,其原理类似于DNA的天然复制过程,是将待扩增的DNA片段和与其两侧互补的寡聚核苷酸引物经过变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增倍数可达2n倍,该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必须工具。
PCR的工作程序如下:
在第一个循环中,目的DNA在加热至95℃,60s左右的条件下分成两条单链;
当降温至55℃(约30s)左右时,引物首先与模板杂交复性;
退火后温度再升至72℃(60s-90s)以进行聚合反应,聚合反应要消耗反应混合物中的dNTPs,并需要Mg2+。
第一次聚合反应中不同的目标分子从引物3’末端开始扩增,不断对目标分子进行拷贝,新合成分子的长度可以各不相同。
当温度再次升高到95℃,变性所有新合成分子的第二次循环开始。
每一对PCR引物长度约为18-30个核苷酸,并且成对引物间的G+C含量应相似,以致使它们在相近的温度下与其互补序列结合。
短的寡核苷酸的退火温度可用下列公式计算:
Tm=2(A+T)+4(G+C),引物与目的序列的相应链退火,结果可通过向3′端加核苷酸相向延伸,较短的片段较易扩增。
1.模板DNA(含有OMP31
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