银杏叶提取物国际商务标准编制说明详解Word下载.docx
- 文档编号:3601448
- 上传时间:2023-05-02
- 格式:DOCX
- 页数:40
- 大小:753.20KB
银杏叶提取物国际商务标准编制说明详解Word下载.docx
《银杏叶提取物国际商务标准编制说明详解Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《银杏叶提取物国际商务标准编制说明详解Word下载.docx(40页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
指标
检验方法来源
鉴别
(1)、
(2)
应符合规定
中华人民共和国药典(2010版)一部银杏叶提取物(鉴别)
指标成分含量
总黄酮醇苷含量,%
≥24.0
中华人民共和国药典(2010版)一部银杏叶提取物(含量测定):
总黄酮醇苷
总萜类内酯含量,%
≥6.0
附录A2,参考美国药典(USP36-NF31)银杏叶提取物标准中银杏萜内酯测定的色谱条件和中华人民共和国药典(2010版)一部银杏叶总萜内酯测定的供试品制备方法;
黄酮苷元峰面积比
槲皮素与山奈酚峰面积比应为
≥0.7
美国药典(USP36-NF31)银杏叶提取物(IDENTIFICATION):
B.HPLC
异鼠李素与槲皮素峰面积比
≥0.1
芦丁含量,%
≤4.0
附录A3,参考中华人民共和国药典(2010版)一部银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定方法,改变了流动相比例和供试品制备方法;
游离槲皮素含量,%
≤0.5
附录A4,参考中华人民共和国药典(2010版)一部银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定方法,仅改变了供试品制备方法;
游离山奈酚含量,%
游离异鼠李素含量,%
≤0.2
总银杏酸含量,mg/kg
≤5.0
附录A5,检测方法参考中华人民共和国药典(2010版)一部银杏叶提取物标准中银杏酸限度的检测,供试品制备方法及标准参考EP7.0银杏叶提取物中银杏酸限度检测方法的标准
粒度(80目筛通过率),%
≥95
中华人民共和国药典(2010版)二部附录ⅪB第二法
水分,%
中华人民共和国药典(2010版)一部附录IXH水分测定法第一法
炽灼残渣,%
≤0.8
中华人民共和国药典(2010版)一部附录IXJ
重金属(以Pb计),mg/kg
≤10
中华人民共和国药典(2010版)一部附录IXE
铅(Pb),mg/kg
≤1.0
中华人民共和国药典(2010版)一部附录IXB
镉(Cd),mg/kg
≤0.3
砷(As),mg/kg
汞(Hg),mg/kg
≤0.1
3.1鉴别
按中华人民共和国药典(2010版)一部银杏叶提取物【鉴别】项下要求:
鉴别
(1)取本品0.2g,加正丁醇15ml,置水浴中温浸15分钟并时时振摇,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加乙醇2ml使溶解,作为供试品溶液。
另取银杏叶对照提取物0.2g,同法制成对照提取物溶液。
照薄层色谱法(药典附录VIB)试验,吸取上述两种溶液各3μL,分别点于同一以含0.4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:
3:
1:
1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝乙醇溶液,置紫外光灯(365mn)下检视。
供试品色谱中,在与对照提取物色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
三批提取物鉴别结果见下图。
鉴别
(2)照薄层色谱法(药典附录VIB)试验,吸取〔含量测定〕项下萜类内酯的供试品溶液和对照品溶液各15μL,分别点于同一以含0.4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂的硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(10:
5:
0.6)为展开剂,在15°
C以下展开,取出,晾干,用醋酐蒸气熏15分钟,在140~160°
C加热30分钟,放冷,置紫外光灯(365nm)下检视。
供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。
3.2总萜类内酯含量测定
银杏萜类内酯是银杏叶提取物中最重要的活性成分之一。
对比国内外药典标准,针对内酯的含量检测,在检测器、样品前处理、色谱条件、含量计算方式等方面,均存在一定差异。
检测器方面:
目前主要采用的检测器有ELSD(如Ch.P、USP)和折光仪检测器(如EP)两种,国内外很多报道的文献,大多采用ELSD检测器,因此本标准仍采用ELSD检测器来检测银杏叶提取物总萜类内酯。
含量计算方式方面:
Ch.P标准采用外标两点法对数方程来分别计算各分内酯的含量;
USP标准采用标准曲线法对数方程来分别计算各分内酯的含量;
EP标准采用苯甲醇为对照分别计算各分内酯的含量(折光仪检测器,暂不考虑)。
研究认为,Ch.P标准的两点法和USP标准的标准曲线法,本身并不存在太大差异,但是由于两点法受对照品浓度大小的限制,加之国内银杏叶提取物规格众多,容易出现同一个样品中,个别内酯测定的峰面积不在对照品相应两点范围内,如此计算所得结果准确性存在一定问题;
同时,两点法所得k、b值的重复性,不如标准曲线法所得k、b值重复性好,测定误差相对较大。
因此,为保证银杏叶提取物总萜类内酯测定结果更准确、可靠,本标准参考USP银杏叶提取物标准,采用标准曲线法对数方程来分别计算各分内酯的含量。
样品前处理及色谱条件方面:
Ch.P2010银杏叶标准采用酸性氧化铝柱纯化,流动相甲醇-THF-水系统测定,银杏叶提取物标准采用乙酸乙酯萃取,流动相正丙醇-THF-水系统测定;
USP标准采用硅藻土柱纯化,流动相甲醇-水系统梯度洗脱;
EP标准采用硅藻土柱纯化,流动相THF-甲醇-水系统测定。
本研究首先对供试品前处理方法进行了对比研究,供试品批号120204、120318,结果如下表。
表3不同前处理方法对比
前处理方法
试剂来源、规格
总内酯含量/(%)
120204120318
乙酸乙酯萃取
国药,分析纯
7.697.01
硅藻土柱纯化
国药进口分装
7.787.18
结果表明,乙酸乙酯萃取和硅藻土柱纯化相比,柱纯化测定结果相对含量稍高,总体上总内酯含量并没有太显著差异。
由于萃取法操作步骤较多,过程比较复杂繁琐,柱纯化方法操作更便捷,在保证含量测定结果没有显著差异的情况下,优选柱纯化方法。
采用同一批供试品(批号120204)对不同柱纯化填料进行了考察,结果见下表。
表4不同前处理填料对比
填料用量/(g)
洗脱剂/用量
硅藻土柱纯化1
Merck
15g
乙酸乙酯/100mL
7.88
硅藻土柱纯化2
Agela
7.32
硅藻土柱纯化3
7.80
酸性氧化铝柱纯化
国药,100-200目
3g
甲醇/50mL
7.85
对比不同填料,只有Agela厂家的硅藻土前处理测定结果偏低,Merck和国药进口分装的硅藻土处理测定的含量和酸性氧化铝处理(暂参考Ch.P银杏叶标准,酸性氧化铝3g,200-300目,柱内径1cm,甲醇湿法装柱;
供试品取样0.15g,)测定结果均相近,没有显著性差异。
相比于硅藻土,采用酸性氧化铝方法填料便宜,所用试剂量较少,检测成本较低。
因此,对该填料开展了进一步研究(供试品批号120204),结果见下表。
表5填料用量比较
酸性氧化铝
柱纯化
2g
7.87
7.82
4g
7.68
5g
表6洗脱剂用量比较
洗脱溶剂/用量
甲醇/20mL
7.31
甲醇/30mL
7.61
甲醇/40mL
7.75
7.84
甲醇/60mL
上述结果表明,供试品取样0.15g,采用经活化的酸性氧化铝3g,湿法上柱,柱径1cm,再用甲醇40-50mL洗脱,可纯化样品,经HPLC-ELSD检测,各内酯分离度良好,含量准确。
综合上述研究结果,本标准参照USP银杏叶提取物标准和Ch.P银杏叶、银杏叶提取物标准,对银杏叶提取物总萜类内酯的检测方法进行了修改,验证结果如下。
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VID)测定
仪器:
Agilent1260系列高效液相色谱仪(ELSD检测器)
3.2.1色谱条件与系统适用性试验:
色谱柱:
AgilentZorbaxXDBC18250×
4.6mm5uμm
流动相:
流动相A甲醇-流动相B水按比例梯度洗脱(Posttime:
10min);
Time(min)
A(%)
B(%)
0–35
2548
7552
35–36
48100
520
36–40
100
检测器:
HPLC-ELSD
柱温:
25℃;
流速:
1.0mL/min。
进样量:
对照品溶液、供试品溶液各10μL。
理论塔板数以白果内酯峰计算应不低于2500。
3.2.2供试品溶液制备
取本品0.15g,精密称定,加甲醇分次溶解,加入装有3g酸性氧化铝的层析柱(酸性氧化铝:
200-300目,经活化处理;
层析柱:
柱径0.8-1.0cm),以甲醇50mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,甲醇溶解并定容至5mL量瓶,若有必要,可用超声波处理。
用0.45μm微孔滤膜过滤,即得。
3.2.3对照品溶液制备
称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量(精确至0.01mg),加入甲醇溶解,制备得每1mL含白果内酯2.4mg、银杏内酯A1.6mg、银杏内酯B0.8mg、银杏内酯C0.8mg的混合对照品甲醇溶液。
再分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍,制备得到5份已知浓度的混合对照品溶液,浓度系列见表A2。
标准使用溶液用0.45μm微孔滤膜过滤后待测。
3.2.4标准曲线试验
精确称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C对照品适量,加甲醇超声溶解,制备混合内酯对照品浓配液。
按比例稀释5个浓度的混合内酯对照品溶液,照含量测定项下的方法测定,经线性回归后得回归方程,结果见下表及图。
表7内酯标准曲线及线性范围
内酯
标准曲线
R2
线性范围/ug
BB
y=1.476x+2.133
0.998
1.67-25.13
GA
y=1.505x+2.080
0.999
0.85-13.83
GB
y=1.356x+2.073
0.86-13.01
GC
y=1.501x+2.060
0.66-10.00
3.2.5仪器精密度试验
取上述混合内酯对照品溶液,连续进样5次,测定。
各成分峰面积RSD均小于2%,仪器精密度良好。
结果见下表。
表8仪器精密度试验(n=5)
序号
1
443.49
173.48
287.53
159.04
2
445.04
174.06
287.76
159.25
3
446.36
174.84
288.29
159.83
4
445.44
174.0
287.38
159.32
5
445.74
174.14
287.61
158.89
A平均
445.3
174.2
287.7
159.3
RSD/(%)
0.21
0.22
0.12
0.23
3.2.6重复性试验
取供试品(批号120204),于同一天内称取5份样品测定,按3.2.2制备供试品溶液,测定总内酯含量,结果见下表。
表9重复性试验(n=5)
总萜类内酯含量/(%)
8.02
7.64
7.92
7.72
平均含量/(%)
1.94
3.2.7中间精密度试验
取供试品(批号120204),在不同天内由不同人员取样、并用不同仪器测定5次,测定结果见下表。
表10中间精密度试验(n=5)
7.58
7.86
7.81
8.05
7.67
7.79
2.32
3.2.8准确度试验
根据重复性试验测定结果,供试品120224总内酯含量为7.82%,含BB3.16%、GC1.04%、GA2.38%、GB1.24%。
精密称取各银杏内酯对照品,加甲醇制成1mL含BB1.2mg、GC0.4mg、GA0.9mg、GB0.45mg的混合内酯对照品贮备液。
取本品(批号120204)约75mg,精密称定,等分为三组,各组分别加入对照品贮备液1.6mL、2.0mL、2.4mL,照3.2.2制备供试品溶液。
照含量测定方法测定,计算回收率,结果见下表。
表11BB加样回收率结果
样品取样量
/mg
样品中含量/mg
对照品加入量/mg
测得总量
回收率
/%
平均回收率
RSD
74.6
2.357
1.92
4.22
97.2
99.11
2.43
75.2
2.376
4.34
102.3
76.5
2.417
4.31
98.6
73.4
2.332
2.4
4.72
99.5
75.6
2.389
4.71
96.6
77.3
2.443
4.89
101.8
74.1
2.342
2.88
5.12
96.5
75.8
2.395
5.20
97.4
76.9
5.37
102.1
表12GA加样回收率结果
1.775
1.44
3.16
96.3
98.54
2.0
1.79
3.19
97.5
1.821
3.24
98.2
1.756
1.8
3.55
99.4
1.799
1.84
3.68
1.764
2.16
3.45
1.804
3.58
100.6
1.83
3.56
98.8
表13GB加样回收率结果
0.925
2.34
98.61
2.12
0.932
0.949
2.35
0.915
2.66
96.8
0.937
2.72
99.1
0.959
2.79
101.5
0.919
3.03
97.9
0.94
3.15
102.4
0.954
3.06
97.7
表14GC加样回收率结果
0.776
2.18
97.8
99.32
2.44
0.782
2.20
98.3
0.796
2.26
101.9
0.768
2.50
96.1
0.786
2.56
98.4
0.804
2.65
102.6
0.771
2.92
99.6
0.788
96.9
0.8
3.01
测定结果显示,本方法四个内酯的回收率在98-100%之间,回收率RSD小于3%,故本检测方法准确度高,实际可行。
3.2.9耐用性试验
本研究对不同品牌色谱柱耐用性进行了初步考察,色谱柱信息及测定结果如下图:
色谱柱1:
AgilentXDBC18250*4.6mm5μm;
色谱柱2:
AgilentSBC18250*4.6mm5μm;
色谱柱3:
Kromasil100-5-C18250*4.6mm;
色谱柱4:
PhenomenexC18250*4.6mm5μm;
从上图可见,采用上述三个厂家四种色谱柱均可有效分离银杏内酯成分,而同品牌的色谱柱,C18150×
4.6mm5μm的色谱柱对目标成分的分离度较差。
为保证各内酯能够有效分离,建议采用C18250×
4.6mm5μm色谱柱,品牌方面,建议安捷伦(Agilent);
菲罗门(Phenomenon)。
3.2.10结果计算
供试品中各萜类内酯组分含量以质量分数Xi计,数值以%表示,按公式(A1)计算,分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的百分含量。
将各组分的百分含量累加计算总萜类内酯的百分含量,按公式(A2)计算。
………………………………(A1)
`
…………………………………(A2)
式中:
X1——供试品中总萜类内酯的质量分数,%;
Xi——某萜类内酯组分含量,%;
ci——从标准曲线中求得的供试品溶液中某组分含量,单位为毫克每毫升(mg/mL);
Vi——供试品溶液总体积,单位为毫升(mL);
mi——供试品质量,单位为毫克(mg)。
3.2.11样品测定
取本品0.15g,精密称定,按3.2.2和3.2.3制备供试品和对照品溶液,测定。
分别计算分内酯和总内酯含量。
多批银杏叶提取物含量测定结果见下表。
表15银杏叶提取物总萜类内酯含量测定结果
样品来源
总萜类内酯/(%)
浙江康恩贝
7.12
8.36
市售提取物1
110901
6.84
市售提取物2
111104
7.03
市售提取物3
111224
7.37
参考Ch.P2010银杏叶提取物标准,本标准规定银杏叶提取物中总萜类内酯含量不得低于6.0%。
3.3黄酮苷元峰面积比
《中国药典》2010年版和USP32-NF27收载的银杏叶提取物质量标准中,均规定了黄酮类成分的峰面积比,槲皮素(Q):
山奈酚(K)峰面积比应为0.8~1.2,异鼠李素(I):
槲皮素应大于0.15。
多年的研究经验表明,黄酮苷元峰面积比可在一定程度上反映银杏叶提取物的内在质量,为杜绝掺假,规范行业标准,应严格加以控制。
本标准参照《中国药典》2010年版一部银杏叶提取物标准【检查】黄酮苷元峰面积比项下要求,按〔含量测定〕项下的总黄酮醇苷色
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 银杏叶 提取物 国际 商务 标准 编制 说明 详解