OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测.pdf
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中波紫外线(UV-B),其波长范围为280320nm,能够穿过大气层到达地球表面。
已知UV-B对植物具有双重效应,即在强度较高时1mol/(m2s)就作为逆境因子对植物造成伤害;而在较低强度下1mol/(m2s)却是一个信号调控因子参与植物的多种光形态建成1。
ROOTUV-BSENSITIVEs(RUSs)是近年来在拟南芥中发现的与极低强度UV-B信号传导有关的基因,它们的共同特点是具有一个功能未知的结构域DUF647,并通过该结构域互作2-3。
经生物信息学分析水稻基因组中也具有6个OsRUS基因,其中OsRUS1在水稻根和叶均有较强表达,但对这一信号传导途径涉及哪些基因,目前尚不清楚。
为了进一步查明这一信号通路的相关基因,拟采用酵母双杂交技术筛选与OsRUS1能够相互作用的蛋白。
OsRUS1开放阅读框(ORF)全长1782bp,结构域DUF647位于5231269bp,为了筛选与OsRUS1互作的基因以及初步确定参与互作的区域,构建了OsRUS1全长及不同区域片段的诱饵载热带作物学报2012,33
(1):
107-110ChineseJournalofTropicalCrops收稿日期:
2011-11-10修回日期:
2012-01-02基金项目:
国家自然科学基金“水稻OsRUS基因家族在UV-B信号传导中的功能研究”(No.30971709)。
作者简介:
潘家强(1985年),男,硕士研究生。
研究方向:
植物抗逆分子生物学。
*通讯作者:
侯学文,E-mail:
。
OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测潘家强1,侯学文1,2*1华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室,广东广州5106422华南农业大学生命科学学院植物功能基因组与生物技术重点实验室,广东广州510642摘要采用PCR技术扩增水稻(OryzasativaL)根UV-B敏感基因1(ROOTUV-BSENSITIVE1,RUS1)四个不同片段OsRUS1(1-1782)、OsRUS1(1-504)、OsRUS1(510-1282)、OsRUS1(1188-1782),连接到T载体pMD18-T-Simple上,测序无误后分别亚克隆到诱饵载体pGBKT7上,酶切和测序结果表明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体构建成功,读码框正确;转化重组载体于酵母感受态细胞Y187中,用LacZ、MEL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD-Trp-DO培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明诱饵载体对酵母菌株Y187没有转录激活活性和毒害作用。
说明构建的4个OsRUS1基因片段的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步从水稻cDNA文库中筛选互作蛋白奠定了基础。
关键词水稻根对UVB敏感基因;诱饵载体;酵母双杂交;自激活;毒性检测中图分类号Q782文献标识码AConstructionofOsRus1YeastTwo-HybridBaitVectorsandDetectionofTheirSelf-activatedActivityPANJiaqiang1,HOUXuewen1,21LabofMolecularPlantPhysiology,CollegeofLifeSciences,South-ChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China2KeyLaboratoryofPlantFunctionalGenomicsandBiotechnology,CollegeofLifeSciences,South-ChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,ChinaAbstractFourfragmentsofrice(OryzasativaL)ROOTUV-BSENSITIVE1(OsRUS1),OsRUS1(1-1782),OsRUS1(1-504),OsRUS1(510-1282),OsRUS1(1188-1782),wereamplifiedbyPCRfromclonedOsRUS1,andwereligatedwithpMD18-T-Simple,thentransformedtoE.coliTOP10competentcell.Thepositivecloneswereselectedandsequenced.TheconfirmedfragmentsweresubclonedtobaitvectorpGBKT7.ThefourconstructedpGBKT7baitvectorswerefurtherconfirmedbyenzymedigestionandsequencing.TheconfirmedpGBKT7baitvectorsweretransformedtoY187yeastcompetentcell.Theself-activationandtoxicityoftheplasmidstohostyeastY187byLacZandMEL1activityassaysandculturinginauxotrophmediumSD-Trp-DOResultsshowedthatthefourconstructedplasmidshadnoself-transcriptionalactivityandnottoxicitytoyeaststrainY187Thefourbaitvectorsconstructedcouldbeusedinyeasttwohybridsystem,whichlaidthefoundationforscreeninginteractionalproteinsofOsRUS1fromricecDNAlibraryKeywordsRiceROOTUV-BSENSITIVE1(OsRUS1);Baitvector;Yeasttwohybrid;Self-activatedtranscriptionalactivity;Toxicitydetectiondoi10.3969/j.issn.1000-2561.2012.01.022第33卷热带作物学报体,并进行这些载体对酵母转录活性的自激活活性及毒性检测,为下一步利用它们筛选水稻cDNA文库获得与OsRUS1互作的蛋白做好准备。
1材料与方法1.1材料酵母(Saccharomycescererisiae)Y187菌株,pGBKT7质粒,阳性对照质粒pGBKT7-53和pGADT7-T(美国Clontech公司),大肠杆菌TOP10菌株以及已克隆的OsRUS1基因pMD18-T-S-BamHI-1-OsRUS1cDNA-1782-MluI由本实验室保存;YNB和蛋白胨(Difco公司),SD-Trp-DO(美国Clontech公司),酵母提取物(OXOID公司),DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶(TaKaRa公司),KOD-Plus-NeoDNA聚合酶和dNTPs(TOYOBO公司),DS2000Marker(东盛生物公司),DNA胶回收试剂盒(普博欣生物公司),2XpowerTaqPCRMix(百泰克生物公司),X-gal(美国BBL公司),X-gal(美国GOLDBIO公司)。
本实验所用引物名称及序列:
OsRUS1cDNA-EcoRI-1-F:
5-AGAATTCATGTCCTCCTCGCAATCTCTCC-3;OsRUS1cDNA-BamHI-504-R:
5-AGGATCCACCGGCCTTCTCCGCATC-3;OsRUS1cDNA-EcoRI-510-F:
5-AGAATTCGTGCCGAGCTGGCTGC-3;OsRUS1cDNA-BamHI-1282-R:
5-GGGATCCTCTTTGACTGAAGGAACTTGTCC-3;OsRUS1cDNA-EcoRI-1188-F:
5-AGAATTCCAATCGATTCAGCTGAGGACACT-3;OsRUS1cDNA-BamHI-1782-R:
5-TGGATCCTTATGAAGGAGCATCTCCTATGC-3;T7sequencingprimer:
5-TAATACGACTCACTATAGGGC-3。
1.2方法1.2.1OsRUS1全长及片段克隆以本实验室已经克隆并测序的pMD18-T-S-BamHI-1-OsRUS1cDNA-1782-MluI为模板,分别以OsRUS1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS1cDNA-BamHI-1782-R,OsRUS1cDNA-EcoRI-1-F/OsRUS1cDNA-BamHI-504-R,OsRUS1cDNA-EcoRI-510-F/OsRUS1cDNA-BamHI-1280-R,OsRUS1cDNA-EcoRI-1188-F/OsRUS1cDNA-BamHI-1782-R为引物,采用高保真酶KOD-Plus-NeoDNA聚合酶反应体系,扩增获得OsRUS1cDNA的4个不同片段。
将这4个片段加A后与pMD18-T-Simple连接,转化E.coliTOP10感受态,筛选获得阳性克隆,并经测序确认无突变。
1.2.2诱饵载体的构建与鉴定将上述克隆并验证的pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pMD18-T-S-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHIMluI和pMD18-T-S-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI,以及空诱饵载体pGBKT7用EcoRI/BamHI双酶切,经琼脂糖凝胶电泳检测酶切正确后,按常规分子生物学连接、转化、筛选,获得pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI4个诱饵载体,分别采用双酶切鉴定及测序确认读码框正确。
1.2.3诱饵载体转化酵母感受态及快速筛选按CLONTECH公司酵母双杂交手册4进行酵母菌株Y187感受态制备及转化。
对SD-Trp-DO营养缺陷板上的菌落进行快速PCR筛选。
方法如下:
挑取1个直径23mm转化酵母菌落于PCR管中,加入30L0.2SDS,漩涡振荡器上振荡15s,然后在PCR仪上90处理4min后,12000r/min离心1min,以上清液作为PCR反应模板。
按10LPCR反应体系加入0.2L提取液作为模板,引物采用对应的基因特异引物,采用PCRpremix进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4诱饵蛋白毒性检测4将上述验证保存的含诱饵载体的Y187分别划线于SD-Trp-DO营养缺陷板,倒置放30恒温箱培养34d至菌落长出后,挑1个较大的菌落(直径23mm)接种于50mLSD-Trp-DO液体培养基中(卡那霉素为20g/mL),30,250r/min过夜摇菌培养,第2天检测培养物的OD600。
1.2.5诱饵载体转录自激活活性的检测4取过夜摇菌培养的阳性菌株(含阳性互作质粒)、阴性菌株(含pGBKT7)以及上述4种转化酵母菌液2mL于离心管中,12000r/min离心15s后弃上清,将离心管在液氮中速冻10min,取出使其自然融解约10min,再重复操作1次,加入50L现配的Z/X-gal液,30静置存放8h染色,以检测报告基因LacZ的表达情况。
分别将含上述4种诱饵载体的Y187菌株以及含阳性对照质粒的Y187菌株,划线于涂有100LX-gal液(4mg/mL)的直径10cm的SD-Trp-DO108-第1期20001000750500bp123456789泳道7为DL2000,泳道1、2为Y187含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI,3、4为Y187含pG-BKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI,5、6为Y187含pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI,8、9为Y187含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI。
图34种OsRUS1诱饵载体转化酵母Y187菌落的PCR筛选图谱20001000750500250bp123456789泳道5为DL2000,泳道1、2、3和4分别为pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-Os-RUS1cDNA-1280-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cD-NA-1782-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI被EcoR1和BamH1酶切图谱,泳道6、7、8和9分别为pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1-Os-RUS1cDNA-1782-BamHI被EcoR1和Sal酶切图谱。
图24个OsRUS1片段诱饵载体的酶切鉴定图谱泳道3为DL2000,泳道1为OsRUS1(1-504)片段,泳道2为OsRUS1(510-1282)片段,泳道4为OsRUS1(1188-1782)片段,泳道5为OsRUS1(1-1782)片段。
图14个OsRUS1片段的PCR图谱1234520001000750500bp板,30静置存放3d,以检测报告基因MEL1的表达情况。
2结果与分析2.14个OsRUS1诱饵载体的构建与验证采用高保真酶KODPlusNeo反应体系分别扩增获得了OsRUS1的4个基因片段(图1)。
将这些片段与pMD18-T-Simple连接、转化,筛选获得阳性克隆,测序确认序列完全正确。
通过EcoRI和BamH1依次将4个不同OsRUS1片段装载到诱饵载体pGBKT7上,再分别采用EcoRI和BamHI以及EcoRI和Sal酶切鉴定(图2),结果符合预期。
用T7sequencingprimer测序表明,4个载体读码框正确,能表达出预期的蛋白,可以用于下一步实验。
2.2酵母的转化及酵母菌落的PCR鉴定结果空白诱饵载体pGBKT7及pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI4个诱饵载体转化的Y187在SD-Trp-DO营养缺陷板上培养3d后即有数量不等的菌落长出,而未转化的Y187却不能在SD-Trp-DO营养缺陷板上生长。
挑取含OsRUS1诱饵载体的4种转化酵母菌落进行快速PCR鉴定,结果均能获得预期大小的条带(图3)。
综合上述结果说明构建的4种诱饵载体成功地转入酵母Y187中。
2.3重组OsRUS1诱饵载体对酵母菌株Y187的毒性检测培养检测结果表明,含pGBKT7、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI的Y187在培养16hOD600分别达到0.964、0.904,含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI的Y187在培养20hOD600分别达到0.887、0.834,含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI的Y187在培养22hOD600达到0.8842,均超过了0.8的判断标准,说明重组诱饵蛋白对酵母Y187生长无毒性,可用于下一步的文库筛选。
2.4重组OsRUS1诱饵载体对酵母菌株Y187的自激活活性检测-半乳糖苷酶显色法实验结果表明,含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI的Y187经8h均未见变蓝,而阳性对照在5h就变蓝(图4),说明这4个基因片段均不会对酵母Y187产生自激活作用,可用于以后的文库筛选。
X-gal平板显色法检测实验结果表明,含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI的Y187菌落培养3d后都未变蓝,为正常白色菌潘家强等:
OsRUS1酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测109-第33卷热带作物学报1234561为阳性对照,2为阴性对照,3为含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI的Y187,4为含pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI的Y187,5为含pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI,6为含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI。
图44种OsRUS1诱饵载体对Y187的自激活活性检测(LacZ法)落,而阳性对照菌落则变蓝(图5),进一步说明这4个基因片段均不会对酵母Y187产生自激活作用,可用于以后的文库筛选。
3讨论与结论酵母双杂交技术是筛选与目标蛋白具有相互作用能力的未知蛋白的高通量技术,自Fields和Song5提出此方法以来,这一技术在研究蛋白互作领域发挥了重要作用,取得了许多成果6-7。
RUS是近年来发现的与植物极低强度UV-B下光形态建成有关的基因,但目前对其信号传导途径尚缺乏认识2-3。
研究清楚与RUS互作的蛋白,将有助于阐明这一信号途径。
本研究首先构建了pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI、pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI、pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI和pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI4种诱饵表达载体(图13),它们分别表达不同片段的OsRUS1蛋白。
为了避免表达的诱饵蛋白的毒性导致酵母细胞不能生长,或某些诱饵蛋白的自激活活性而影响筛选结果,需要在筛选前验证诱饵载体的毒性与自身激活作用,如吴建国等8研究就发现编码水稻瘤矮病毒Pn10的S10基因就对酵母具有自激活活性,这样的诱饵载体就不能用于文库的筛选。
本研究采用含这些诱饵表达载体的Y187摇菌培养,OD600全部能在22h以内达到0.8,说明表达的OsRUS1及其片段对酵母的生长无毒性;对LacZ和MEL1报告基因活性染色表明(图4、5),OsRUS1及其片段也不能激活酵母的转录系统。
综上所述,构建的4个OsRUS1诱饵质粒融合蛋白对宿主菌Y187无毒性,且无自激活作用,可以应用于下一步筛选水稻cDNA文库以获得与OsRUS1互作的蛋白。
参考文献1FrohnmeyerH,StaigerD.Ultraviolet-Bradiation-mediatedresponsesinplants.BalancingdamageandprotectionJ.PlantPhysiol,2003,133:
1420-1428.2TongHY,LeasureaCD,HouXW,etal.RoleofrootUV-BsensinginArabidopsisearlyseedlingdevelopmentJ.ProcNatlAcadSciUSA,2008,105:
21039-21044.3LeasureCD,TongHY,YuenGG,etal.ROOTUV-BSENSITIVE2actswithROOTUV-BSENSITIVE1inarootultravioletB-sensingpathwayJ.PlantPhysiol,2009,150:
1902-1915.4ClontechLab.MatchmakerTMlibraryconstruction&screeningkitsusermanualM.Version,2007.5FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractionsJ.Nature,1989,340:
245-247.6RizziniL,FavoryJJ,CloixC,etal.PerceptionofUV-BbytheArabidopsisUVR8proteinJ.Science,2011,332:
103-106.7DuarteDT,HulS,SacherM.AyeasttwohybridscreenidentifiesSPATA4asaTRAPPinteractorJ.FEBSLetters,2011,585:
2676-2681.8吴建国,蔡丽君,胡梅群,等.水稻瘤矮病毒P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测J.热带作物学报,2009,30(9):
1364-1368.1为阳性对照,2为含pGBKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-504-BamHI的Y187,3为含pGBKT7-EcoRI-510-OsRUS1cDNA-1280-BamHI的Y187,4为含pGBKT7-EcoRI-1188-OsRUS1cDNA-1782-BamHI,5为含pG-BKT7-EcoRI-1-OsRUS1cDNA-1782-BamHI。
图54种OsRUS1诱饵载体对Y187的自激活活性检测(MEL1法)责任编辑:
沈德发110-
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