苯丙氨酸解氨酶的研究进展综述.pdf
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安徽农业大学学报,200128(4):
425430JournatolAnhuiAgriculturalUniversity苯丙氨酸解氨酶的研究进展(综述)江昌俊,余有本(安徽农业大学农业部茶叶生物技术重点开放实验室,合肥230036)摘要:
苯丙氨酸解氨酶(PA1)是催化苯丙烷类代谢途住第一步丘应的酶,也是这个途径的关键酶和限速酶,对撞物有非常重要的生理意义。
本文对苯丙巍酸解氨酶的存在与分布、纯化与性质、生理代谢意义、抗逆境以蕊基因克隆与表达等方面进行了比较全面的概述。
关键调:
苯丙氨酸解氨酶生理意义;基因克隆与表达中国分娄号:
Q814文献标识码:
A文章编号:
10002197(2001)04042506植物的代谢分为初级代谢和次级代谢。
植物的次级代谢有多杀选径苯丙烷类代谢途径是其中裎重要的一条对植物有非常重要的生理意义。
一切舍苯丙烷骨架的物质都是由这一途径直接或间接生成莽草酸速径产生的莽草酸通过分枝酸、预苯酸经转氨作用生成苯丙氨酸,从而进入苯丙烷粪代谢逾径,苯丙烷粪代谢可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物,这些酸可以进一步转化为香豆索、绿原酸,也可以形成CoA酯再进一步转化为类黄酮、术质索等。
苯丙氨酸解氨酶(phenylaanineammonia-lyasePAL)是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶,是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶也是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶。
淀粉rCtip一E4P1PAL的存在和分布TPEPt丙酮酸r莽草酸选衽oo+HO本丙氨酸肉占,蛋誊装肉桂酸蛋白质合成香豆索糖苷质素异黄酮及缩酚酸类酯若干生物碱苯甲酸酯精甘其他l5碳化台物图1苯丙烷类代谢的一般途径FigurelGeneralpathwayofphenylpropanoidmetabolism1961年Kouko【和CormE首次从植物中发现了这种酶并进行了分离纯化此后关于这种酶的研究迅速展开随着分离纯化的方法不断完善,已成功地从水稻、小麦、马铃薯、橙树、草莓、芥菜、大豆、茶树和豌豆、杨耐【伽等多种植物中分离纯化得到PA1。
至今PAI已在所有绿色植物中发现,在真菌、细菌、藻类中也有存在。
经研究发现,不同种植物中PA1活性不同,如水稻叶的PA1活性远比小麦的高:
在同一株植物中不同的组织部收稿日期:
2001-02一l9作者简介;江昌梭(1957一),男,硕士,教授维普资讯http:
/426安徽农业太学学报位PAL活性也不同,一般来说越嫩的部位PAL活性越高如萌发5d的黄化水稻幼苗,其幼叶、根、胚轴、肛芽鞘中PA1的活性依次降低,肛乳中无活性杨树的幼叶、顶芽、幼茎中PAl活性最高,而老茎和成熟叶中PAI活性则很低”。
在茶叶中,PAL活性也随叶片成熟度的增加而降低1在细胞水平上,植物的PAL主要分布在表皮下的细胞和维管组织细胞中。
在亚细胞水平上,PA1定位于细胞质和一些膜细胞器如叶绿体、白色体、线粒体、过氧化酶体、乙醛酸体口。
JinNakushima等口也进行了PAl的亚细胞定位,发现细胞间质部分PAl活性晟高,电子显微术显示PA1分散在细胞的基质中,定位在高尔基体囊泡和攻生壁加厚层中。
2PAL的分离纯化和性质PAl的分离纯化主要步骤是:
将植物材料在缓氮中固定,用硼酸缓障液研磨匀浆,砂布过滤,离心后弃沉淀即得粗酶液粗酶渡经过硫酸铵分级沉淀、DETE一纤维索层析、亲和层析等步骤,即可得到纯化的PAI蛋白常用自年PAl活性测定方法有两种,一种方法是L6:
称取1g鲜叶,液氮固定研磨,然后用O1motI硼酸缓冲渣(pH88)提取,4C100O0g离心得租酶液检测反应液总体积5mI(内含0Imoll硼酸缓冲渣(pH88),120motIL-苯丙氨酸,粗酶液1mL),3o反应60min,加02mI6molLHCt终止反应,290nm测OD值,以OD值变化0o1为一十酶活性单位另一种方法是:
用005moilTrisHCI缓I申液(pH88)提取,反应液总体积12mL(内含005molLTrisHCI(pH88),1mmolLL一苯丙氨酸,粗酶液200FI),30c反应45min,加lml2molIHCt终止反应,再加3mI甲苯离心5min后吸取甲苯相在290inm下测吸光度值。
PAL酶蛋白一般是一十分子量在220330kDa的酸性蛋白。
酶蛋白由四个亚基组成,多数PAl,有均一的亚基,分子量为5588kDa。
不同植物中PAI的氨基酸组成不同,如水稻中的PAL酸性成分少于小麦、玉米、马钟薯而中性成分高于以上三种植物哪。
不同来源的PAL最适pH在8O95之间,水稻中PAI最适pH值偏碱,这和其氨基酸组成相一致。
PAL没有单一的Km值,一般在loql0叫之间PAI的活性中心部位具有脱氢丙氨酰基的亲电中心。
3PAL对植物生理代谢的意义苯丙烷类途径可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物,这些中间产物可进一步转化为香豆索、绿原酸,也可形成反式香豆酰辅酶A酯,再通过多条途径进一步转化为木质索、黄酮、异黄酮、生物碱、苯甲酸酯糖苷等攻生代谢产物。
这些产物在植物的生长发育过程中起着重要的作用,而这些物质的含量总是与PAI的活性密切相关,所以PAl对植物的生理意义非常重太。
31在细胞分化和木质化中的作用2O世纪7o年代以来,PAl与细胞分化的关系已有不少报道m州,发现愈伤组织分化过程中PAl活性有所增高在分化组织中有管状分子形成主要是由于木质索在细胞壁中的沉积。
Tubery和Notheote在多种植物中发现在木质化组织中含有较高的PAL活性,而在这些植物的非木质化组织中不能检测到PAl活性。
JinNakashima等用分离的百日草叶肉细胞研究了苯丙烷类代谢酶类与木质索、管状分子形成和细胞分化的关系,发现在百日草细胞分化过程中,术质索的合成及管状分子形成与PAL活性的增加成正相关m,细胞溶质中的PAL活性在术质化之前迅速上升,而微粒体和细胞壁的PAL活性在木质化期间快速增加。
32在植物色素形成过程中的作用早在l960年,Nfish就证实了PAl催化花青索的合成。
苯丙烷类产物反香豆酰辅酶A经过类黄酮途径可生成花色索、花色素苷等,这些都是植物花朵、果实和叶片颜色的重要组成部分,而且这些物质的合成都与PAI的活性密切相美。
苋红索是中央种子目植物所特有的色素,用白光、蓝光或红光照射琵穗苋黄化苗后,发现PAI活性均有不同程度的上升,并有苋红索的积累0:
33在植物的根癯形成过程中的作用苯丙烷类代谢产物经类黄酮途径可产生黄酮类化台物,这些化合物对根瘤菌有趋化作用0,有些类黄酮化台物还可作为根瘤苗结瘤基因的诱导物质。
这些黄酮类物质的含量与PAI活性存在着密切的关系,在根瘤菌的形成过程中常伴随着PAL活性逐渐增加4PAL在植物抗逆境中的作用研究发现,许多植物在遭受寒冷、伤害。
、紫外辐射州时,植物的防卫系统特别是苯丙烷类代谢被撇活,PAl活性迅速上升,因此PAI活性可以作为植物抗逆境能力的一十生理指标。
41PAL在植物抗病中的作用411PAL-b植物抗病性的关系1964年,Minamauka和Uritani首先发现植物感染病原苗后PAl活性有明显增强的函氍维普资讯http:
/28卷4期江昌役等苯丙氪酸解氨酶的研究避展(综述)487现象以后陆续发现多种植物受病原菌侵染后PAl活性明显升高并表现出规律性的变化归纳至今的研究成果发现PAL与植物抗病性有以下几个基本特点:
(1)植物感病后PAL活力发生有规律的变化。
感染最初几小时上升比较缓慢,随后活性急剧上升达到顶峰接着活性叉急剧下降。
马铃薯感染晚疫病、小麦感染白粉病:
和赤霉病、苷蔗感染黑穗病”、玉米感染小斑病和大斑病伽、菠萝感染黑心病“烟草感染赤星病、苹果感染褐斑病:
、水稻感染稻瘟病叫和白叶枯病m叫后PA1活性变化均有以上特点。
(2)致病菌对PAL活性的影响远大于非致病菌,且病原菌接种后,抗感品系的PAl活性均有所增加,但病原菌作用于抗病品系植物诱导所产生的PAL活性远比感病品系高卜。
Iosehke等在豌豆试验中发现,病原菌Fusariumsotanigpisi诱导的PAL活性比非致病菌Fsolanifphaseito要高50。
李爱贞等-枷用白叶枯病菌接种不同抗性水稻叶片后发现PAL活性增长率与品系的抗病性成正相关而用无菌水模拟接种后感抗品系活性上升幅度相当。
(3)用毒素处理同病原菌接种感染一样能刺激PAI活性升高而且毒索的作用显得更强烈,反应酌更早(4)从真菌培养液和菌丝细胞壁制备的激发因子也能诱导PAl活性的增加:
,用寡聚半乳糖醛醵酶(PGA)处理杨树后也可引起PAL快速而短暂的上升这是因为,PGA可以释放细胞壁的果腔部分这些物质可以起到内源激发因子的作用激发植物的防卫匣应(5)病原菌的侵染病毒素诱导或真菌培养液的诱导所引起的PAL活性的增加辐度与这些激发因子的浓度有关或者说与植物的受害程度有关且在侵染点周围病原菌对酶活性刺激作用高于离侵染点较远的部分,在最边缘部位PAL活性与未感染部位基本相同_1。
(6)诱导子诱导后随着PAL活性的升高,苯丙烷类代谢途径及其下游途径中的某些酶类的活性也升高,如在寡聚半乳糖醛酸酶(PGA)或两种真菌诱导子诱导下PAI、4-香豆酸COA联结酶(4一CL)、葡萄糖苷酶均剧烈上升,且变化规律非常相似,基本上同步口412PAL誊与植柏抗病的机制
(1)参与木质素的台成。
PAl是苯丙烷类代谢途径的关键酶,也是合成术质素的关键酶。
木质素的形成,可以增加细胞壁的厚度,增加组织术质化程度,形成病原菌侵的机械屏障1-,烟草受TMV漫染畸,棉花受枯萎病菌侵染_55,小麦受白粉菌c侵染后,随着PAL活性的提高,均出现木质素的积累。
(2)参与植保素的合成。
植保素是植物受侵染或胁迫而产生的一类低分子量抗微生物的化合物,主要包括酚类植保素(绿原馥、香豆素和儿茶酚荨)、异黄酮类植保素(豌豆索、菜豆素大豆素、苜蓿黄索等)和萜烯类植保素其中,前两类都是苯丙烷类代谢的直接或间接产物,其生成量与PAl活性成正相关关系。
用PGA或真菌诱导子处理杨树后发现,随PAL活性的增加,与细胞壁结合的酚类化合物大量积累。
用PAI抑制荆L一2氨氧基一3一苯丙酸和n一氨氧基一乙酸处理植物幼苗,植物体内植保寨合成和积累受到抑制42PAL与植物抗虫性的关系关于PAL参与植物抗虫方面的研究报道较步,但关于苯丙烷类代谢途径与植物抗虫性的报道已有很多,主要集中在这一代谢途径的产物(术质素、植保素)与植物抗虫性的关系方面。
木质素的积累,可使细胞壁加厚,成为食草类动物取食的机械障碍,而植保索对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用,这些化合物的生成与PAL含量存在着间接的关系。
许多实验证明,PAL活性高低与植物的抗虫性有很大关系,而且食草类动物的取食也可诱导很高的PAL活性口。
许宁等的研究发现,在抗橙樱螨的茶树品种中PAL的活性高于抗性弱的品种。
李润植等-怔研究棉花和蚜虫的互作关系时发现,不同类型品种棉花在棉蚜为害胁迫下PA1、PPO和多酚类含量均有不同程度上升且抗蚜品种上升快,防御反应及时。
s植物PAL基因的克隆与表达到目前为止,已对拟南芥删、法国豆、豌豆欧芹彤、松树、杨树、甜马铃暮【州、水稻、烟草、番茄”、菜豆:
、甜瓜、苜蓿叭J、芬树等植物PAl基因进行了cDNA克隆和序列分析。
研究表明PAL基因的普遍特点是由小的多基因家族组成,如杨树的PAl基因至少有2个菜豆有3个欧芹有4个而茶讨中只有1个。
而且PA1基因在植物中的表达具有组织特异性,如菜豆的PAl的3个基因PAL、PAl和PAL。
都能在根部大量表达,而PA1。
仅在叶中表达,花瓣中PALz大量表达tPAl表达量很少,PAl。
不表达。
PAL是一种诱导酶,可以受多种因素的诱导。
各种类型的低温0。
、机械损伤0州、光(白光、蓝光、红光、紫外光)l5_、病原苗感染m、毒素处理sost和昆虫取食都可诱导PAl基因的表达,且这种诱导是在转录水平上的诱导。
用真菌诱导子接种欧芹叶细胞悬浮培养液接种后初期(68h)PA1mRNA在大范围内高度表达,明显高于对照,只有在最边缘地区与未感染区表达程度差不多,但在整个区域内都没有发现PAL酶蛋白的增加;在约I2h后,坏死斑形成,PA1mRNA急剧收缩到坏死斑周围井在此区域内,PAl酶蛋白有少量增加;接种后约25htPAlmRNA表达基本恢复到原来水平,而PAL酶蛋白在坏死斑周围被强烈地诱导台成生长素(IAA)、澈动素(BAP)和乙烯(乙烯利)都可诱导植物PA1基因的表达,刺激效应乙烯IAABAP也维普资讯http:
/428安徽农业大学学报2001正有研究表明,赤霉紊(GAa)的刺激也能诱导PAI活性的升高0。
植物在生长发育过程中及受病原苗及其诱导物和伤害等刺激时,PAlmRNA常伴随着内源激素台成量的增加而增加更有趣的是各种因子对PAI的诱导存在着互作关系如在切伤诱导甘暮块根切片PAI活性增高时,IAA、BAP、乙烯能再使PA1的活性增加I且BAP的效应叉可被照光而增强植物体内有一种内携【性抑制物质(PA1一1)参与PAI活性的调节,这已在马铃薯、印度小黄瓜、萝b、向日葵中得到证实,并已在水稻中得到提取纯化这种PAl一I不仅能抑制水稻PAI还能抑制从小麦、玉米、马铃薯块茎中提取的PAL,但不能抑制其他酶类|。
研究还发现单子叶植物幼苗胚乳中普遍存在PAl内源抑制物质的调节因子(PALIR)去胚乳后,内携【抑制物质增加幼苗中PAl活性下降双子叶植物子叶对PAI的调节作用不具有普遍性D。
6结柬语上从几十方面综述了近年来国内外对苯丙氨酸解氨酶研究的重要进展。
可以看出,PAL是植物砍生代谢中一种非常重要的酶类,在植物的生长发育过程和抗病虫中起着非常重要的作用。
国内外对这种酶的研究较多也较裸入,主要集中在它的提取纯化、抗逆境、生理作用、基因克隆等方面但关于它的基因表达和调控方面的研究还不多,需要进一步展开更深入更广泛的研究,以便为将来的基因工程育种工作(特别是抗病虫育种)提供理论依据。
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