液相色谱样品预处理.docx
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液相色谱样品预处理
论文题目:
液相色谱样品预处理技术
摘要
样品预处理在样品分析中具有极为重要的地位,样品预处理方法研究已经成为分析化学学科的热点问题。
本文在对液液萃取、固相萃取及膜分离等几类在液相色谱分析中应用广泛的样品前处理方法的原理及特点进行详细阐述的基础上,进一步从原理上推导和指明了改进的方向。
并介绍了上述方法的常用装置、基本操作过程及实验条件选择,对不同基质样品的液液萃取中萃取溶剂的选择、固相萃取中吸附剂及洗脱条件的选择、固相微萃取条件的选择及膜分离中膜种类选择及膜清洗等进行了综述。
为液相色谱样品预处理操作提供系统的参考。
关键词
液相色谱;样品预处理;原理及特点
Abstract
Samplepretreatmentplaysaveryimportentroleinanlyticalchemistry,andtheresearchofsamplepretreatmenthasbeenthehottopicofanlyticalchemistrydiscipline.Baseontheexpansionofthemechanismandcharacteristicofliquid-liquidextraction,solidphaseextractionandmembraneseparation,whichhavebeenwidelyusedinliquidchromatography,indetail,theimprovementdirectionofthesesamlepretreatmentmethodsareputforwardinthispaper.Moreover,thecommondevices,operationprocessesandtheoperateconditionsofthosesamplepretreatmentmethodsareintroduced.Theselectionofextractingsoventsinliquid-liquidextration,adsorbingmaterialsandwashingsoventinsolidphaseextration,extractiontime,tempretureandpHvalueinSolidPhasemicroextraction,membranetypeandwashingconditionsaresummarizedforcommonsamples,aimingforsupplyingsystematicconsultsforsamplepretreatmentinliquidchromatographyanalysis.
Keywords
liquidchromatogram;samplepretreatment;mechanismandcharacteristi
目录
摘要I
AbstractII
前言1
第一章样品预处理方法2
1.1液体样品预处理2
1.1.1固相萃取2
1.1.2液液萃取2
1.1.3稀释2
1.1.4蒸发3
1.1.5蒸馏3
1.1.6微渗析3
1.1.7冷冻干燥3
1.2悬液样品预处理3
1.2.1过滤3
1.2.2离心4
1.2.3沉降4
1.3固体样品预处理4
1.3.1固液萃取4
1.3.2索氏提取4
1.3.3强制流动浸出5
1.3.4均匀化5
1.3.5超声5
1.3.6溶解5
1.3.7加速溶剂萃取(ASE)5
1.3.8自动索氏提取6
1.3.9超临界流体萃取6
1.3.10微波辅助提取6
1.3.11热提取6
第二章液-液萃取8
2.1液-液萃取的基本操作9
2.2液-液萃取溶剂的选择9
2.3液液萃取常用装置11
第三章固相萃取12
3.1固相萃取的原理及特点12
3.2固相萃取常用的吸附剂13
3.3洗脱剂15
3.4固相萃取装置及操作16
3.4.1固相萃取装置16
3.4.2固相萃取操作18
3.5固相微萃取18
3.5.1固相微萃取技术的工作原理19
3.5.2固相微萃取装置及操作步骤20
3.5.3固相微萃取条件选择22
第四章膜分离24
4.1膜分离原理24
4.2膜的分类24
4.3膜分离过程的类型及特点25
4.4膜分离装置26
4.5膜分离技术存在的问题及解决方法27
4.5.1浓差极化27
4.5.2膜污染27
4.5.3膜清洗28
结论29
参考文献30
致谢33
前言
随着科学技术的进步,仪器分析方法的自动化程度、灵敏度越来越高,所涉及到的样品也越来越复杂,因此,对样品预处理技术的要求也越来越高,并得到广泛关注。
2011年底在杭州召开了第一届全国样品预处理学术研讨会,最近,也将由中国科学院大连化学物理研究所关亚风教授在国内组织第一次国际样品预处理国际会议,这也预示着样品预处理技术已经成为分析化学学科的热点问题。
色谱分析的全过程主要包括四个步骤:
样品的采集、样品的制备、色谱分析及数据处理与结果的表达。
其中,样品的采集包括取样点的选择和样品的收集、样品的运输和贮存;样品的制备包括将样品中欲测组分与样品基体和干扰组分分离、富集及转化成色谱仪器可分析的形态。
色谱分析样品的采集和制备是一个非常重要的和复杂的过程,通常将色谱样品的采集和样品的制备统称为色谱分析样品预处理。
现代色谱仪器对样品的分析所用时间越来越短,但是样品的制备过程所用时间却仍然很长。
统计表明[,],大部分色谱分析实验室中用于色谱分析样品制备过程的时间约占整个分析时间的约2/3,而只有10%的时间用于色谱分析,其余时间用于分析测定结果的整理和输出报告等。
对于提高工作效率而言,改善和优化色谱分析样品制备的方法和技术是一个重要环节。
液相色谱对样品的要求是液体或者是可溶解在某些溶剂中的固体,通常是不挥发或难挥发的样品,而且其中不能含有微小的颗粒物,以免色谱柱发生堵塞。
此外,在使用色谱技术进行样品分析时,常常会遇到采集的原始样品不适合于直接进行色谱分析的要求,样品中目标组分的含量很低,特别是原始样品基体干扰大的情况,诸如样品是粘滞的流体、胶体溶液或者固体等,这使得色谱分析的样品制备方法及其技术在现代色谱分析中越来越重要[]。
迄今为止,除用于已知样品组成与测定范围的流程色谱仪外,色谱仪器还不能做到在现场环境直接收集样品并自动地完成样品的选择、分离和测定等步骤,一般需要离线进行样品的采集和处理[]。
第一章样品预处理方法
按照样品形态来分,样品前处理技术主要分为固体、液体、气体样品的前处理技术。
固体样品的前处理技术主要有索氏提取、微波辅助萃取、超临界流体萃取和加速溶剂萃取等。
液体样品的前处理技术主要有液一液萃取、固相萃取、液膜萃取、吹扫捕集、液相微萃取等。
气体样品的前处理方法有固体吸附剂法、全量空气法等。
1.1液体样品预处理
1.1.1固相萃取
技术原理:
液体流过能选择性地捕集被测物(或干扰物)的固定相;捕集的被测物可用强溶剂洗脱下来;有时,保留干扰物而允许被测物通过固定相、不被保留;机制同HPLC。
评述:
用于选择性捕集所需无机、有机和生物被测物的固定相有很多种;也有用于药物、烃类、儿茶酚胺和许多其它种类的化合物、痕量水富集的特殊固定相。
1.1.2液液萃取
技术原理:
样品在两种不混溶的液相中分配,应选溶解性差异较大的液相。
评述:
注意勿形成乳液–––加热、加盐可使之破坏;用不同溶剂或影响化学平衡的添加剂(如缓冲剂调节pH、盐改变离子强度、络合试剂、离子对试剂等)改变KD值;有许多连续提取低KD或大体积样品的报道。
1.1.3稀释
技术原理:
用与HPLC流动相相容的溶剂稀释样品,避免色谱柱超载,或使其浓度在检测器线性范围内。
评述:
为避免谱峰扩展,溶剂应于HPLC流动相混溶;“稀释即可进样”是简单的液体样品如药物制剂的一般样品制备方法。
1.1.4蒸发
技术原理:
在大气压下缓缓加热除去液体,可通过气流、惰性气体或真空辅助操作进行。
评述:
蒸发勿过快;爆沸会损失样品;注意样品在容器壁上的损失;勿过热蒸干;在惰性气体下蒸发较好,如N2;最好使用旋转蒸发器;已有自动系统(如Turbovap)可用。
1.1.5蒸馏
技术原理:
加热样品至溶剂的沸点,挥发性被测物在蒸汽相中浓缩、冷凝和收集。
评述:
主要用于易挥发的样品;如加热温度太高,样品会分解;低蒸气压化合物可用真空蒸馏;蒸汽蒸馏最高温度为100C,相当温和。
1.1.6微渗析
技术原理:
主要用于易挥发的样品;如加热温度太高,样品会分解;低蒸气压化合物可用真空蒸馏;蒸汽蒸馏最高温度为100C,相当温和。
评述:
渗析物需用富集技术浓缩,如SPE;微渗析用于检测活性动植物组织和发酵液中细胞外的化学物质;已与微LC柱在线联用;由于高分子量蛋白不能通过滤膜,用分子量截止膜的渗析也能在线用于HPLC样品的脱蛋白;同样可用超滤与反渗析法。
1.1.7冷冻干燥
技术原理:
冷冻水溶液样品,真空下水分被升华除去。
评述:
有利于非挥发性有机物;可处理大体积样品;可能损失挥发性被测物;能浓缩无机物。
1.2悬液样品预处理
1.2.1过滤
技术原理:
液体通过滤纸或滤膜,滤除悬浮颗粒。
评述:
极力推荐该法以排除反压问题,延长色谱柱寿命;滤膜必须与溶剂相兼容,使其在实验中不致溶解;大孔径(2m)滤器可提高流速,小孔径滤器(0.2m)可除去细菌。
1.2.2离心
技术原理:
样品放于锥形离心管中,以高速旋转;倾出上清液。
评述:
有时从离心管中取出定量固体样品较难;超速离心一般不用于去除简单微粒。
1.2.3沉降
技术原理:
在沉降容器中静止放置,使样品沉淀;沉降速率取决于Stoke半径。
评述:
为一极慢过程;依照沉淀速率,可在不同水平下人工回收不同粒径的微粒。
1.3固体样品预处理
1.3.1固液萃取
技术原理:
样品置于具塞容器内,加入溶剂溶解被测物;从固体中滤出溶液(有时亦称“振摇/过滤”法)。
评述:
有时可煮沸或回馏溶剂以提高溶解度;细小分散状态的样品易于浸出;样品可用人工或自动振摇;经过滤、倾析或离心等操作,从不溶性固体中分离出样品。
1.3.2索氏提取
技术原理:
样品置于活动的多孔容器(套管)中;回馏溶剂连续流过该套管,溶解被测物,连续收集到蒸馏瓶中。
评述:
以纯溶剂提取;样品在溶剂的沸点处必须稳定;缓慢,但提取直至完成不需有人照看;价低;对自由流动粉末最好;回收率很好(可用于其它固相萃取法的参照标准)。
1.3.3强制流动浸出
技术原理:
样品置于流通管中,并使溶剂从中流过。
加热流通管至溶剂的沸点附近。
评述:
适于颗粒性样品;溶剂能用高压N2注入或推过;所需溶剂体积小于索氏提取;结果相似,速度更快。
1.3.4均匀化
技术原理:
样品置于混合器中,加入溶剂,使样品均一化成细小离散状态;除去溶剂,进一步混匀。
评述:
用于动植物组织、食品、环保样品;可用有机及水溶剂;可加干冰或硅藻土增大样品的流动性;对小分散样品的萃取效率较高。
1.3.5超声
技术原理:
细小的分散样品浸没于装有溶剂的超声容器中,进行超声辐射。
也可用超声探头或杯型超声破碎器进行操作。
评述:
用超声作用辅助溶解;可加热提高萃取速率;安全、快速;最适于粗糙、颗粒状物质;可同时处理多份样品;与溶剂的接触效率高。
1.3.6溶解
技术原理:
用强溶剂直接溶解试样,使被测物溶入溶液,避免发生化学发应。
评述:
无机固体可能需加酸或碱达到完全溶解;有机样品往往能直接溶于溶剂中;溶解后,可能需要滤过。
1.3.7加速溶剂萃取(ASE)
技术原理:
样品置于密封容器中,加热至沸点以上,使容器中的压力上升;自动取出萃取样品,并转移至小瓶中作进一步处理。
评述:
可大大加快液-固萃取过程;自动化;容器必须能耐高压;萃取的样品较稀,需进一步浓缩;由于使用高压、高温溶剂,需有安全措施。
1.3.8自动索氏提取
技术原理:
热溶剂浸出与索氏提取的结合;套管中的样品先浸没在沸腾溶剂中,然后升温,进行常规索氏提取/用回馏溶剂淋洗,最后浓缩。
评述:
人工与自动操作均可;所需溶剂量少于传统索氏法;溶剂可回收利用;由于二步操作,可减少提取时间。
1.3.9超临界流体萃取
技术原理:
样品置于流通容器中,超临界流体(如CO2)流过样品;降低压力后,提取的样品收集在溶剂中或捕集到吸附剂上,然后再以溶剂淋洗解吸附。
评述:
人工与自动操作均可;可采用改变超临界流体密度或加入改性剂的方法,改变超临界流体的极性;收集的样品通常较浓,因为CO2在提取结束后即被除去,因此相对无污染;基质影响提取过程;方法建立的时间可能比其它现代方法长。
1.3.10微波辅助提取
技术原理:
样品置于开口或密闭的容器中,以微波能量加热,使被测物被提取到溶剂中。
评述:
提取溶剂可分为吸收微波溶剂(MA)和不吸收微波溶剂(NMA)两种;采用MA,样品置于高压容器中,如加速溶剂萃取(ASE),充分加热至沸点以上;采用NMA时,容器可开口操作,无压力升高现象;微波箱中用有机溶剂(MA或NMA)与MA在高压操作时,需有安全操作规程。
1.3.11热提取
技术原理:
采用动力学顶空进样形式,但加热样品至很高(可控制)的温度,可高达350C。
评述:
系统必须由熔融石英或熔融硅胶制造,使提取的被测物不至于与热金属表面发生反应;应避免系统局部过冷;适用于蒸气压较低的样品。
第二章液-液萃取
液-液萃取(LLE)常用于样品中目标组分与基质的分离。
根据目标组分在两种互不相容液体(或相)之间的分配,达到纯化目标组分、消除基质干扰的目的。
多数情况下,一种液相是水溶剂,另一种液相是有机溶剂。
可通过选择两种互不相容的液体,以控制萃取过程的选择性和分离效率。
在水和有机相组成的液-液萃取体系中,亲水化合物的亲水性越强,进入水相的比例越大;而憎水性化合物进入有机相的比例也越大。
通常,在有机溶剂中分离出感兴趣的目标组分。
有机溶剂多具有较高的蒸气压,可以便利地通过蒸发的方法将溶剂除去,以浓缩目标组分。
由能斯特(Nernst)分配定律可知,在温度、压力等条件不便的情况下,任何种类溶质在两不互溶的溶剂中的浓度之比保持恒定:
(2-1)
其中KD为分配常数,Co为被测物在有机相中的浓度,Caq为被测物在水相中的浓度。
因此,被测物被萃取进有机相的分数为:
(2-2)
其中Vo为有机相的体积,Vaq为水相的体积,V为两相体积的比值Vo/Vaq。
大多数液-液萃取操作可在分液漏斗中进行,每一相的体积一般需几十至几百毫升。
采用一步提取时,由于相比V必须保持在一定范围内,因此,KD对于定量回收目标组分必须足够大。
当定量回收率大于99%时,需采取两步或多步萃取操作。
多步萃取后,合并每步萃取得到的被测物,总分数E可表示为:
(2-3)
其中n为萃取次数。
例如某被测物的KD=5,两相的体积相等(V=1),被测物回收率>99%,则需要三步萃取操作。
可以采用以下几种方法增大KD:
1.更换有机溶剂,以使KD增大。
2.如目标组分是离子型或可电离的化合物,通过抑制其离子化,增大其在有机相中的溶解度;也可在有机相中添加离子对试剂,使被测物与其结合形成离子对,并被萃取进有机相。
3.可在水相中加入惰性的中性盐(例如硫酸钠),用盐析法降低目标组分在水相中的浓度。
2.1液-液萃取的基本操作
用液–液萃取(LLE)可从干扰物中分离出目标组分,基于其在两种不互溶的液体(或相)中的分配系数的不同,达到分离的目的。
萃取进有机相的被测物经溶剂挥发容易回收,而萃取进入水相中的被测物经常能够直接注入反相HPLC中进行分离分析。
将目标组分由水溶液萃取进有机相中的基本操作如图2-1所示。
将表组分萃取入水相时,使用的方法与此类似。
图2-1LLE步骤框图
由于萃取为一平衡过程,效率有限,两相中仍存在数量可观的被测物。
因此可利用包括改变pH、离子对、络合作用等提高回收率,或消除干扰。
2.2液-液萃取溶剂的选择
LLE中所采用的有机溶剂必须满足以下条件:
1.在水中有较低的溶解度(10%);
2.具有挥发性,萃取后易于除去使样品浓缩;
3.与HPLC检测技术相容(避免使用对UV有吸收强的溶剂);
4.极性并可形成氢键,以利于提高有机相中被测物的回收率;
5.纯度高,尽可能降低对样品的污染。
表2-1提供了一些典型的萃取溶剂的示例。
除考虑互溶性外,溶剂的极性
以及与目标组分极性的关系是主要的选择标准。
极性匹配时,KD值最大。
混合两种极性不同的溶剂(如己烷和氯仿)并测定其KD,能够方便地找到最佳极性的有机溶剂配比。
表2-1LLE的提取溶剂
水溶剂
与水不互溶的有机溶剂
与水互溶的有机溶剂
(不适于LLE)
纯水[]
酸溶液[]
脂肪烃类(己烷、异辛烷、石油醚等)
二乙基醚或其它醚
醇类(低分子量的)
酮类(低分子量的)
碱溶液
二氯甲烷
醛类(低分子量的)
浓盐(盐析作用)
氯仿
羧酸类(低分子量的)
络合剂(离子交换,螯合,手性等)
乙酸乙酯和其它酯
脂肪酮类(C6及以上酮)
乙腈
二甲基亚砜
以上两种或多种混合
脂肪醇类(C6及以上醇)
二氧六环
甲醛、二甲苯(有UV吸收!
)
以上两种或多种混合
在溶剂萃取中,离子型被测物按所选用条件的不同,其在两相中的分配系数也会不同。
如果被测物的KD不适宜,可能需另外的萃取方法以提高回收率。
这种情况下,在原样品中重新加入不混溶的溶剂,提取剩余的溶质,最后合并所有的提取液。
一般来说,最终提取溶剂的体积一定时,多次萃取比单次萃取的溶质回收率高。
也可以用反提法进一步减少干扰物。
如果KD非常低或所需样品的体积很大,多步提取将不实用,这种情况可采用连续液–液萃取方法
2.3液液萃取常用装置
在连续液-液萃取中,新鲜的有机溶剂可以循环地连续使用,通过含有被萃取的水相。
图2-2给出了连续液-液萃取器的结构图。
使用比水重的有机溶剂进行萃取。
这种萃取溶剂从烧瓶中被加热蒸馏,上升到冷凝器被冷凝,并淋漓出两种不混合的水和带有萃取物的溶剂。
最后,溶剂和萃取物返回到烧瓶中。
此过程连续地进行直到足够量的被测物质被萃取出来。
图2-2所示的装置也可以使用比水轻的有机溶剂进行连续萃取。
撤去溶剂返回管,用两个塞子堵住接口,并将一端带有玻璃筛板的漏斗管放进萃取器中,在萃取器中放人样品和溶剂。
冷凝的溶剂流入漏斗,由于冷凝液的静压高差通过玻璃筛板。
较轻的溶剂通过液体上升并且由于在萃取管中溢出而返回到烧瓶中。
如果使用玻璃微珠充填萃取管内空间以减少萃取体积,给萃取溶剂提供弯曲的途径以改进液-液接触。
图2-2连续液-液萃取装置示意图
1-萃取溶剂收集器;2-气态溶剂;3-萃取溶剂;4-冷凝器;5-萃取液;6-溶剂返回管;7-溶剂萃取返回到收集器;8-漏斗管;9-玻璃筛板
对于效率更高的LLE,如逆流分配装置能提供上千次的平衡分配。
可对KD值极小的被测物进行抽提;逆流分配也可使被测物与干扰物更好地分离。
微萃取为LLE的另一种模式,其提取在有机/水比例为0.001~0.01范围内进行[,]。
与常规的LLE相比,回收被测物会受妨碍,但目标组分浓度在有机相中有很大提高,所用溶剂也大大减少。
这种萃取可以很方便地在容量瓶中进行。
选择密度小于水的有机提取溶剂,以便使小体积的有机溶剂聚集在瓶颈处,方便取出。
对定量分析来说,应该使用内标,以对提取结果加以校正。
第三章固相萃取
固相萃取(SolidPhaseExtraction,SPE)是一种由柱色谱发展而来的样品预处理技术,所用的填料粒径(>40µm)大于HPLC填料粒径(3~10µm)。
SPE与HPLC的差别是柱压低、塔板数少、分离效率较低、一次性使用,因此只能分离保留性质有很大差别的化合物。
由于SPE实现了选择性的提取、分离、浓缩三位一体的过程,操作时间短、样品量小、干扰物质少,因此可用于挥发性和非挥发性组分的预处理,并具有很好的重现性。
[,]
3.1固相萃取的原理及特点
SPE技术基于液-固色谱理论,采用选择性吸附、选择性洗脱的方式,实现样品的富集、分离、纯化,是一种包括液相和固相的物理萃取过程,也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。
固相萃取整个过程可分为吸附和洗脱两个部分。
在吸附过程中,当溶液通过吸附剂床层时,由于吸附剂对目标组分的吸附力大于溶剂的吸附力,因此被选择性地吸附到吸附剂床层上,实现样品的富集。
此过程中由于共吸附作用、吸附剂选择性等因素的存在,部分干扰物也会在吸附剂床层上吸附。
吸附过程完成后,通过加入一种对分离物的吸引大于吸附剂的溶剂使目标组分脱附。
在此过程中,首先要选用适当的溶剂对吸附在吸附床层上的干扰物进行洗脱,然后再用洗脱剂对目标物质进行洗脱。
3.2固相萃取常用的吸附剂
吸附剂是固相萃取的核心,吸附剂选用的好坏直接关系到能否实现萃取操作,以及萃取效率,同时新型吸附剂的研发也是固相萃取技术发展和应用的关键所在。
早期的吸附剂多为活性炭、氧化铝等强吸附性材料。
常用的固相吸附材料有正相、反相和离子交换吸附剂三种。
正相吸附剂主要包括硅酸镁、氨基、氰基、双醇基硅胶、氧化铝等,适用于极性化合物的萃取;反相吸附剂包括键合硅胶C18、键合硅胶C8、芳环氰基等,适用于非极性至一定极性化合物的萃取;离子交换吸附剂包括强阳离子吸附剂(苯磺酸、丙磺酸、丁磺酸等)和强阴离子吸附剂(三甲基丙基胺、氨基、二乙基丙基胺等),适用于阴阳离子型有机物的萃取。
目前国内外已经研制出多种复合型吸附剂。
聚合二乙烯苯-N-乙烯吡咯烷酮及其盐是一类性能独特的反相吸附剂,独有的亲水和亲脂性质保持其在水中湿润,能同时萃取极性物质和非极性物质。
以氯甲基化的高分子树脂PS-DVB(苯乙烯-联苯乙烯共聚物)与二乙撑三胺反应制成的新型的阴离子交换聚合树脂,能同时萃取离子型和非离子型化合物;将碳化吸附剂与PS-DVB合用,能同时萃取强极性化合物和离子型化合物;将未封尾的C18硅胶与单官能团的C18硅胶混合,可以扩大C18柱的极性范围。
[,,]
免疫亲合型吸附剂是基于抗体-抗原相互作用的原理而研制出来的新型固相吸附剂。
首先制备一种专属性的抗体,然后将其固定在琼脂糖或硅胶上,当样品通过吸附床层时发生抗原-抗体结合,从而专属性地将目标组分分离出来。
这种吸附剂是目前已知选择性最强的固定吸附剂。
近年来,这种吸附剂越来越多地被应用于医学、生物学以及环境分析等领域。
分子印记型吸附剂是一类新型的高选择性吸附剂,能从复杂的生物基质中选择性地提取出微量分析物[]。
表3-1SPE固定相及应用条件
分离机制
典型固定相
结构
被测物类型
装载溶剂
洗脱溶剂
正相
吸附极性键合相
硅胶,氧化铝,
硅酸镁
氰机、氨基、二醇基
-SiOH,AlOH,Mg2SiO3
–CN,–NH2,
–CH(OH)–CH(OH)–
弱至中等极性
中等至强极性
低P'(己烷、CHCl3)
低P'(己烷、CHCl3)
高P'(如甲醇,乙醇)
高P'(如甲醇,乙醇)
反相
非极性键合相:
疏水强
非极性键合相:
疏水中等
非极性键合相:
疏水弱
十八烷基硅氧烷
八烷基硅氧烷
环己基,苯基,联苯基
丁基,乙基,
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