免疫共沉淀原理及实验方法.doc
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免疫共沉淀原理及实验方法
2007-03-2216:
07:
46
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免疫共沉淀
一原理:
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。
为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。
每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。
抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。
欲速则不达,确定好比例很必要。
(待续)
二准备:
器械
#微量高速冷冻离心机
#移液枪
#旋转盘
#电泳设备
#vortex震荡器
#液氮及组织粉碎器
#eppentube
试剂
#细胞或组织
#蛋白定量kit
#SDS电泳试剂
#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清)
#PBS
#NaN3
#proteinAsapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1.RIPA缓冲液(最终浓度)
1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)
5MNacl15ml(150mM)
0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)
20%TritonX-10025ml(1%)
10%DOC50ml(1%)
10%SDS5ml(o.1%)
TLCK18.5mg(0.1mM)
TPCK35mg(0.2mM)
DDW395ml
toal500ml
另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。
注意不易溶于水)
2.NP40lysis缓冲液
1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)
5MNacl15ml(150mM)
0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)
20%NP4025ml(1%)
TLCK18.5mg(0.1mM)
TPCK35mg(0.2mM)
DDW450ml
toal500ml
使用前加1mM的PMSF
注意点:
*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。
*反复使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC 注意忘记加TritonX-100,只加DOC,SDS,可能使抗体完全失去活性。 1的蛋白变性效果强,可能损害抗原/抗体结合,2的作用温和,却可能造成抗原溶解不全。 *两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。 根据自己需要调节。 EDTA用NaOH滴定。 Protocol 1调制proteinAsapharose proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS 离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存 用单抗做一抗时,把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清)。 旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s 去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次 加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。 避免长期保存。 2.抗原的检出 以下操作全在冰面或4度进行 去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。 加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。 RIPA的量: 6cm的培养皿加1ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。 30m,15000rpm离心,上清转移到新tube。 不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube 往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h 加proteinAsapharose50ul,再混匀1h 5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。 往sapharose加RIPA,vortex混匀,离心,去上清。 重复4次洗净。 加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。 3.注意点 A: 不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。 对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。 B: 对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。 (完) 文章引用自: 评论()引用阅读(876)圈子编辑打印有奖举报 免疫共沉淀原理及实验方法 [SPANclass=javaid=text9766]免疫共沉淀[BR]一原理: [BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。 目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。 [BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。 抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。 建议仔细检查抗体的说明书。 特别是多抗的特异性是问题。 [BR][BR]其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。 多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。 为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。 另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。 即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 [BR][BR]再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。 [BR][BR]每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。 抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。 缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。 欲速则不达,确定好比例很必要。 (待续)[BR]二准备: [BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清)[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinAsapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液(最终浓度)[BR]1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)[BR]5MNacl15ml(150mM)[BR]0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)[BR]20%TritonX-10025ml(1%)[BR]10%DOC50ml(1%)[BR]10%SDS5ml(o.1%)[BR]TLCK18.5mg(0.1mM)[BR]TPCK35mg(0.2mM)[BR]DDW395ml[BR]toal500ml[BR]另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。 注意不易溶于水)[BR]2.NP40lysis缓冲液[BR]1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)[BR]5MNacl15ml(150mM)[BR]0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)[BR]20%NP4025ml(1%)[BR]TLCK18.5mg(0.1mM)[BR]TPCK35mg(0.2mM)[BR]DDW450ml[BR]toal500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点: [BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。 [BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。 [BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。 TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC<SDS是离子性的强活性剂。 注意忘记加TritonX-100,只加DOC,SDS,可能使抗体完全失去活性。 1的蛋白变性效果强,可能损害抗原/抗体结合,2的作用温和,却可能造成抗原溶解不全。 [BR]*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。 根据自己需要调节。 EDTA用NaOH滴定。 [BR]Protocol[BR][BR]1调制proteinAsapharose[BR][BR]proteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时,把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清)。 旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s[BR][BR]去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。 避免长期保存。 [BR][BR]2.抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。 加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。 RIPA的量: 6cm的培养皿加1ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。 [BR][BR]30m,15000rpm离心,上清转移到新tube。 不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube[BR][BR]往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h[BR][BR]加proteinAsapharose50ul,再混匀1h[BR][BR]5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。 往sapharose加RIPA,vortex混匀,离心,去上清。 重复4次洗净。 [BR][BR]加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。 [BR][BR]3.注意点[BR]A: 不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。 对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。 [BR]B: 对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。 (完)[/SPAN][BR] 查看文章 4.免疫共沉淀技术路线(CoIP) 2007-05-0709: 14 准备工作: 预冷PBS,RIPABuffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机 1.用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS; 2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上) 4.4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中 5.准备ProteinAagarose,用PBS洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6.每1ml总蛋白中加入100μlProteinA琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景 7.4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除ProteinA珠子 8.(Bradford法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1: 10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月) 9.用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10μg/μl) 10.加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育 12.加入100μlProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG) 13.14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPAbuffer洗3遍,800μl/遍,RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS 14.用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60μl足够上三道) 15.将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。 RIPABuffer配制: 基础成分: Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性) NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集) NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存) 注意: 准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH7.4) 亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂 激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见SodiumOrthovanadateActivationProtoco) NaF(200mM的储存液,室温保存) 注意: 在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂 工作液配制: 配制100ml的modifiedRIPAbuffe: 1.称取790mg的Tris-Base,加到75ml去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4 2.加10ml10%的NP-40 3.加2.5ml10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清 4.加1ml100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存 5.理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100µl;PMSF,Na3VO4,NaF各500µl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度: •Tris-HCl: 50mM,pH7.4 •NP-40: 1% •去氧胆酸钠: 0.25% •NaCl: 150mM •EDTA: 1mM •PMSF: 1mM •抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1µg/ml •Na3VO4: 1mM •NaF: 1mM 通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1.用磷酸盐缓冲液洗30块10cm培养板上的适宜细胞。 刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15min。 3.收集上清(约30ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1h。 4.加入0.9ml的蛋白质A-Sepharose悬液,4℃摇动免疫沉淀物30min。 5.用含900mmol/LNaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。 最后,用NETN洗一次。 6.吸出混合物的液体部分。 加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4min。 7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10mA的恒定电流下电泳过夜。 8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml50%乙腈洗两次,每次3min。 10.用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。 11.通过窄孔高效液相色谱分离肽。 将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
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