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南台科技大学
南台科技大學
生物科技系
學生專題
利用不同濃度STZ與施打方式探討與持續性高脂飲食合併STZ誘導糖尿病腎病變動物模式之關聯性
專題生:
495H0068陳宣侞,495H0098邱筱涵,495H0907鄭嘉惠
指導教授:
褚俊傑
中華民國九十九年五月
摘要
在台灣糖尿病腎病變(diabeticnephropathy)是引起末期腎病(end-stagerenaldisease)的主因,而糖尿病和腎臟病又分別佔十大死因中第五和第七位。
不論糖尿病或非糖尿病所誘發之腎病變動物模式,除了基因缺陷型,如KK/HIJ小鼠或是使用脂多醣進行腹腔注射的化學藥劑誘導型外,都沒有較成熟的糖尿病併發腎病變動物模式,提供研究者進一步探討糖尿病性腎病變各時期的病理變化過程,如初期腎損傷和後期腎纖維化之形成的分子機轉等。
本計畫研究方向,欲建立一個非基因遺傳缺陷糖尿病小鼠性的糖尿病性腎病變動物模式,是因為基因缺陷小鼠雖然廣範應用在二型或一型糖尿病動物模式研究,但其價格昂貴,繁殖也較為不容易且執行較為困難,在我們先前的研究中發現,將Streptozotocin(STZ)以低濃度施打,可誘導初期糖尿病腎病變症狀,而從前人文獻得知,施打高低濃度的STZ與Nicotinamide(NA)可誘發不同層級的腎病變,本計畫以施打STZ+NA誘導模式為基礎,但在STZ及NA的施打濃度做改變,希望誘發的不同層級的糖尿病腎病變病徵,藉此模擬臨床活體內因血糖代謝異常因素所造成的不同時期糖尿病性腎病變,合併胰島素抗性的逐漸產生與嚴重腎功能病變之發生,造成尿中尿蛋白含量大量增加,以求建立不同時期的糖尿病腎病變動物模式。
關鍵字:
糖尿病腎病變、Streptozotocin(STZ)、胰島素抗性、尿蛋白
目的原由與介紹
在臺灣及許多先進國家中,糖尿病是造成末期腎病(end-stagerenaldisease,ESRD)的主要因素。
長期非胰島素依賴型糖尿(long-durationnon-insulin-dependentdiabetes)[第二型]以及胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependentdiabeticmellitus)[第一型]都有可能演變為糖尿病腎病變(diabeticnephropathy)。
糖尿病的腎病變過程一般是先由微白蛋白尿症(microalbuminuria)開始,然後變為蛋白尿(proteinuria)或氮血症(azotaemia),最終導致末期腎病。
此外,在臨床的病理特徵上有文獻指出,在15歲以前診斷的糖尿病有一半在40歲以前就因腎衰竭死亡。
[1,2]
腎病變主要發在腎絲球微血管,使其基底膜增厚,最後整個血管叢阻塞,當臨床上出現蛋白尿,則暗示可能有腎臟病變。
在糖尿病尿患者的腎臟組織切片也發現,其腎絲球的結構與常人相比以不完整及萎縮,並扮隨造成大量胰臟細胞的散落與細胞核流失的情形,進而破壞胰臟細胞的叢集與分化,最後導致胰島細胞產生不可逆之病理傷害與功能失調。
上述兩種病理特徵都因為糖尿病引起的血糖代謝異常,而最終造成對組織的嚴重傷害。
相較於其他因素所誘發的末期腎病變,糖尿病腎病變的病人罹患心血管系統疾病(尤其是冠狀動脈與腦血管疾病)的致死率非常高。
[3,4]
目前國內外現有之糖尿病或非糖尿病所誘發之腎病變動物模式,除了基因缺陷型如KK/HIJ小鼠,就是使用脂多醣進行腹腔注射的化學藥劑誘導外,都沒有較成熟的糖尿病併發腎病變動物模式,[5,6]提供研究者進一步探討糖尿病性腎病變各時期的病理變化過程,如初期腎損傷和後期腎纖維化之形成的分子機轉等。
[7]故本計畫研究方向,欲建立一個非基因遺傳缺陷糖尿病小鼠性的糖尿病性腎病變動物模式,因為基因缺陷小鼠雖然廣範應用在二型或一型糖尿病動物模式研究,但其價格昂貴,繁殖也較為不容易且執行較為困難,透過用不同濃度STZ合併NA一起從腹腔注射C57BL/6小鼠,使其未進時血糖超過180mg/dl,以口服葡萄耐受性(OralGlucoseToleranceTest)和胰島素耐受性(InsulinToleranceTest)及相關血液生化值測試(如:
TG、TC、HDL/LDL)等相關糖尿病生化值指標,確立糖尿病之生理影響,同時再收集誘導後小鼠尿液,量測ACR(albumin-creatinineratio)、BUN、Cre等中後期腎病變尿液生化值,結合上述糖尿病之生理影響,建立不同時期糖尿病性腎病變動物模式以利後續相關研究之進行。
實驗步驟與材料
適用糖尿病性腎病變之品系小鼠6週大,其性別為雄鼠,先給予脂肪含量40%之高脂質飼料八週之後,先以腹腔注射Nicotinacmid(NA)200mg/Kg,15分鐘後再腹腔注射Stroptozocin(STZ)100mg/Kg、75mg/Kg、50mg/Kg分別連續六天、七天、十四天,使其非禁食血糖值超過200mg/dl,環境為12/12光暗週期變換,溫度控制24±2℃,食物及水則無限量供應,並且每週測量一次體重。
口服葡萄糖耐受度測試:
適用糖尿病性腎病變之品系小鼠在給藥前和給藥二週及四週時,測量葡萄糖耐受性異常程度。
將小鼠禁食10小時後,先以尾部取血方式,使用血糖儀MAJORII測定小鼠的空腹血糖,接著以口服方式給予3g/Kg葡萄糖至該品系之各組,在給予葡萄糖後的15、45、95、135分鐘的時間點測量血糖值,觀察曲線變化。
胰島素耐受性測試:
適用糖尿病性腎病變之品系小鼠在給藥前和給藥二週及四週時,測量胰島素耐受性。
將小鼠禁食10小時後,先以尾部取血方式,使用血糖儀MAJORII測定小鼠的空腹血糖,接著腹腔注射胰島素0.5U/Kg至該品系之各組,在注射胰島素後的15、45、95、135分鐘的時間點測量血糖值,觀察曲線變化,藉以得知每隻小鼠對胰島素的敏感度差異;若在注射完胰島素後,血糖濃度並未降低,即表示細胞無法接收到胰島素所攜帶的訊號。
糖尿病腎病變相關生化值測試-血液:
依動物實驗設計各時間點,誘導前後和給藥二週及四週時,將上述各組實驗動物,採血進行相關生化值檢測。
動物如不需麻醉也不用以保定器保定,以眼窩採血方式,確認有血液流出後再以採血管承接。
採取約0.5ml全血,經5000rpm10分鐘離心後,取0.2ml血清以進行生化值實驗,血液生化值(總膽固醇TC、三酸甘油脂TG、高密度脂蛋白HDL和低密度脂蛋白LDL、尿素氮BUN)是由Hitachimodel7600automaticanalyzer以比色法原理測得。
糖尿病腎病變相關生化值測試-尿中蛋白含量:
尿中蛋白含量測定,藉由代謝籠方式安置老鼠於代謝籠中24小時並收集蛋白尿,再於各時間點,誘導前後和給藥二週及四週,刺激實驗室動物排尿,收集尿液後,送交醫檢所檢測。
結果與討論
Fig.1(A)
Fig.1(B)
Fig.1(A)為C57BL/6小鼠在誘導前後及四週後等時間點,其血糖代謝相關數據,可得知經過NA200mg/kgi.p.injection15min後無論是在STZ75mg/kg或是STZ50mg/kg2cycle組別中,在OGTT的數據都可看到皆成功誘導出高血糖的糖尿病動物模式。
而誘導四週後,STZ50mg/kg2cycle組別與STZ70mg/kg組別血糖升高的情形更加明顯。
(B)為在ITT試驗中,誘導後也似乎有胰島素抗性產生,而此現象也以延續到四週後的數據。
Fig.2
Fig.2為C57BL/6小鼠在誘導前後及四週後等時間點,其血液相關生化值數據,觀察到STZ50mg/kg2cycle誘導血中總膽固醇明顯上升,而STZ75mg/kg組別也有些微上升,但HDL/LDL的比值與TG的含量皆無明顯變化。
而四週後,在血中膽固醇分析,觀察到STZ50mg/kg2cycle誘導血中總膽固醇降至正常值,而STZ75mg/kg組別則保持不變,但HDL/LDL的比值與TG的含量皆無明顯變化。
Fig.3(A)
Fig.3(B)
Fig.3(A)(B)為C57BL/6小鼠在誘導前後及四週後等時間點,其腎病變相關生化值數據,在血中尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)部份,發現在誘導後BUN呈現下降,而在誘導後或誘導四週後此趨勢皆無明顯變化。
在血中肌酣酸(bloodcreatinine,Cre)分析,雖然在STZ75mg/kg組別有呈現升高之現象但並無實質統計意義,而STZ50mg/kg2cycle組別與後續時間點皆看到下降之趨勢,此點與在BUN所呈現一致,但其原因還需探討。
Fig.4
Fig.4為C57BL/6小鼠在誘導前後及四週後等時間點,其腎病變之蛋白尿相關數據,STZ50mg/kg2cycle組別在ACR表現量中較STZ70mg/kg組明顯,且兩組與Normal相比皆有明顯差距,可推測STZ50mg/kg2cycle引發腎損傷的程度較大。
誘導四週後STZ50mg/kg2cycle組別ACR大幅下降,顯示STZ對於腎臟損害的作用已經被恢復,而STZ75mg/kg組別則無明顯變化。
Fig.5(A)Fig.5(B)
Fig.5(C)Fig.5(D)
Fig.5(A)(B)(C)(D)為餵食高脂質飼料(HFD)兩個月後施打STZ(50mg/kg)+NA(200mg/kg)誘導後,在誘導前後及四週、八週等時間點,其腎病變之蛋白尿相關數據(ACR)之數據,可發現在與Normal組別比較,誘導後隨著時間點其蛋白尿表現也上升。
結論
在我們先前的研究中發現,透過高脂質飼料(high-fatdiet)方式餵食八週後,再從腹腔注射STZ+NA,連續施打七天,可使C57BL/6品系小鼠,誘導出初期的糖尿病腎損傷狀態,而我們透過本計畫所使用的不同濃度STZ施打,從相關腎病變生化數據可發現的確可誘導出大量蛋白尿之現象,而在BUN和Cre卻在各時間點卻沒太大改變,此外同時在血液相關生化值(TG、TC、HDL/LDL)及腎病變相關生化值(BUN、Cre、ACR)都可發現在剛誘導後都有增加之趨勢,但在四週後,卻都有恢復之趨勢,這點在先前使用高脂質餵食合併STZ注射之誘導模式沒有見到的。
可見對於維持糖尿病腎病變動物模式之病程發展,高脂質餵食是不可或缺之條件,本欲透過此計畫挑選出適合觀察不同層級糖尿病腎病變動物模式之誘導方式,根據實驗結果在合併先前之實驗數據,推論若選擇高脂質餵食合併STZ50mg/kg2cycle此誘導方式,可誘發不同層級之更嚴重糖尿病腎病變動物模式。
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