复方转移因子激发CD4+T淋巴细胞的实验研究.docx
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复方转移因子激发CD4+T淋巴细胞的实验研究
复方转移因子激发CD4+T淋巴细胞的实验研究
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
作者:
李玉虎 缪株雷 程国强 张辉 侯庆萍
【摘要】目的用化疗药物建立免疫细胞抑制的动物模型,以免疫细胞为观察指标评价复方转移因子的提高免疫细胞的能力。
方法用环磷酰胺(CTX)灌胃(100mg/kg),隔天一次,连续五次,造成免疫功能抑制的动物模型,通过不同实验组用药前后免疫细胞的变化,以评价复方转移因子高、中、低(相当人用量的2、5、10倍)剂量组是否能提高实验动物的免疫细胞。
结果复方转移因子能显著提高实验小鼠白细胞数量,复方转移因子低、中、高剂量组与模型组比较,P0.01,差别有极显著性;复方转移因子能显著提高实验小鼠淋巴细胞百分比及CD4+T淋巴细胞的绝对数,P0.01,差别有极显著性。
结论复方转移因子能提高实验小鼠WBC及CD4+T淋巴细胞的数量,并与剂量有关。
【关键词】复方转移因子;CD4+T淋巴细胞;环磷酰胺;动物模型
【Abstract】ObjectiveAnimalmodelofimmunosuppressionhasbeenfoundbychemotherapeutics.AbilityoftraditionalChinesemedicinecompoundtransferfactorimproveimmunocyte,thisresultmaybeevaluatedbyimmunocyteasaindex.MethodsAnimalmodelofimmunosuppressionhasbeenfoundbyusingcyclophosvnamideforintragastricadministration,onetimeeachotherday,lavaging5timesconsecutively.EvaluatedtraditionalChinesemedicinecompoundtransferfactorhigh、medium、lowdosagegroups(equalto2、5、10timesofpeopleusing)improveornotimmunocyteofexperimentalanimalsthroughchangesofimmunocytebeforeandafterdifferentexperimentalgroupshavebeengiventomedicines.ResultTraditionalChinesemedicinecompoundtransferfactorcanincreaseremarkablyamountsofWBC.TraditionalChinesemedicinecompoundtransferfactorhigh、medium、lowdosagegroupscomparetomodelgroup,P0.01,thedifferenceisextraordinarysignificance.ItcanelevateremarkablypercentagesoflymphocyteandabsolutenumbersofCD4+Tlymphocyteofexperimentalmouses,P0.01,thedifferenceisextraordinarysignificance.ConclusionTraditionalChinesemedicinecompoundtransferfactorcanboostquantumsofWBCandCD4+Tlymphocyteofexperimentalmouses,concernedwithitsdosages.
【Keywords】Compoundtransferfactor;WBC/CD4+Tlymphocyte;Cyclophosvnamide;Animalmodel
HIV病毒是一种杀细胞性病毒,此病毒主要在CD4+T淋巴细胞内大量增殖并破坏细胞。
而CD4+T淋巴细胞是人体中极其重要的免疫细胞,它的破坏,逐渐导致免疫功能衰竭。
这样,即使对正常人来说是一个微不足道的感染,如小伤口或普通感冒,也可能致艾滋病患者于死地。
因此,通常患者不是死于HIV感染本身,而是各种继发的机会性感染和肿瘤。
关于HIV发病机理的研究近年来出现了一些新的观点,如“HIV病的肠道主要病灶论”认为肠免疫组织是最易感的解剖部位,在正常情况下,肠道免疫系统处于生理性活化状态和生理性低反应性状态,其生理性活化状态为HIV感染提供了大量的易感细胞。
而在HIV感染时,由于危险信号的释放,调节性T细胞优先被删除等原因导致生理性低反应性状态被打破,而出现免疫过度活化,从而产生更多的易感细胞,通过直接感染以及活化诱导细胞凋亡,使肠道T细胞在短期内大量丢失,从而导致免疫缺陷.初步说明了“HIV病的肠道主要病灶论”的可能性[1-2]。
本实验以此为依据,用环磷酰胺灌胃,造成实验动物肠道淋巴细胞(也包括血液淋巴细胞)大量下降的动物病变,可模拟HIV中、晚期的免疫状态(CD4+T淋巴细胞↓)。
用体外对T淋巴细胞有增殖作用的中药复方来治疗,从而达到利用中药复方来干扰CD4+T淋巴细胞大量下降的病变而终止HIV病变的进程。
这种方法可在普通实验室进行,成本低廉,可用于大样本初筛,安全无传染。
如用HIV(SIV)病毒[3],则费用高,传染性强。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1动物KM小鼠,100只,雌雄各半,体质量(18±1)g,清洁级动物,中科院上海实验动物中心提供,合格证:
scxk(沪)2007-0005。
1.1.2实验室气象条件温度22℃~25℃,湿度40%~70%。
1.1.3试剂与仪器
1.1.3.1试剂环磷酰胺(CTX),江苏恒瑞医药股份有限公司生产,批号07041721。
复方转移因子,本实验室制备。
健康猪脾,用超滤仪超滤,得转移因子溶液(10mg/ml左右)[3-6]。
中药紫花地丁、甘草等。
煎煮二次,浓缩后加食用酒精提取。
二者按一定的比例混合,得复方转移因子。
复方转移因子制剂中的转移因子含量为4mg/10ml和中药生药含量为1g/10ml。
1.1.3.2仪器全自动血液分析仪(型号XE-2100),流式细胞仪(型号FACSCalibur)。
1.2造模方法与药物干预
1.2.1分组100只KM小鼠随机均分为5组,每组20只,雌雄各半。
灌胃体积1ml/次,20g。
正常对照组(0.9%NaCl灌胃,环磷酰胺不灌胃);模型组(0.9%NaCl灌胃,同时环磷酰胺灌胃);复方转移因子低剂量组(药物相当人用量的2倍,同时环磷酰胺灌胃);复方转移因子中剂量组(药物相当人用量的5倍,同时环磷酰胺灌胃);复方转移因子高剂量组(药物相当人用量的10倍,同时环磷酰胺灌胃)。
1.2.2实验过程上述各组按设计分别进行灌胃并称体质量,环磷酰胺灌胃分别于实验的第1天,第3天,第5天,第7天,第9天,环磷酰胺灌胃剂量为100mg/kg,在第1、3、5、7、9天下午环磷酰胺灌胃,上午药物灌胃,第1~14天每天药物灌胃。
第15天各组称体质量,采血,送实验室检测白细胞、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、CD4+T细胞等。
1.2.3观察项目①小鼠体重变化;②小鼠血液白细胞、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、CD4+T细胞等。
1.3统计学方法实验数据以统计软件SPSS11.5进行统计分析,用药组与模型对照组计量资料比较运用t检验。
2结果
2.1各组小鼠在实验第1天和第15天的体质量结果如下。
2.2各组小鼠在实验第15天眼眶取血1~2ml,立即送检,全自动血液分析仪分析血液各项指标。
注:
正常对照组与模型组比较,**P0.01;复方转移因子低剂量、中、高剂量与模型组比较,△△P0.01;复方转移因子低剂量、中、高剂量与正常对照组比较,##P0.01;复方转移因子中、高剂量组与低剂量组比较,P>0.05。
3讨论
用环磷酰胺灌胃造成实验动物肠道(及血液)CD4+T淋巴细胞大量下降的动物病变,可模拟HIV中、晚期的免疫状态。
用体外对T淋巴细胞有增殖作用的中药复方来治疗,从而达到利用中药复方来干扰CD4+T淋巴细胞大量下降的病变而终止HIV病变的进程[7-10]。
基于上述理由,本研究提出如下工作假说:
本课题通过中药复方的干预作用,以延长生存时间为目的。
在艾滋病中、晚期主要是因为CD4+T大量下降,引起免疫缺损,而转移因子在体内外均可使CD4+T分裂增殖。
CD4+T分裂增殖到达一定的数量就使艾滋病的病理进展中断,从而使带毒生存时间大大延长。
第二,本制剂中的紫花地丁、野菊花、白头翁等,在体外实验中具有抑制SIV的作用。
本制剂如果在体内能有效抑制HIV,则可阻止艾滋病的病理进展,提高艾滋病患者的带毒生存期。
从这一工作假说出发,本课题在方法学上观察实验动物用药前后CD4+T细胞水平。
以评价中药复方的药物效果。
这为中药复方的临床应用提供依据。
本次实验造模方法是灌胃,剂量为100mg/kg,连续5次用环磷酰胺灌胃后,可造成典型的WBC和CD4+T细胞下降的动物模型[11-12]。
小鼠的体质量结果经统计学分析,正常对照组与模型组比较,P0.01;说明环磷酰胺可造成实验动物体质量下降;复方转移因子低、中、高剂量与模型组比较,P>0.05,差别无显著性,说明复方转移因子对实验小鼠的体质量无影响;复方转移因子低、中、高剂量与正常对照组比较,P0.01。
说明复方转移因子对实验小鼠的体重无影响。
小鼠WBC结果经统计学分析,正常对照组与模型组比较,P0.01,差别有极显著性,说明用环磷酰胺灌胃,可造成典型的WBC下降的动物模型;复方转移因子低、中、高剂量与模型组比较,P0.01,差别有极显著性;说明复方转移因子有抵抗环磷酰胺造成WBC下降的作用。
小鼠淋巴细胞百分比、CD4+、CD8+T细胞百分比和CD4+、CD8+T细胞的绝对数经统计学分析,结果见附表3。
用药各组与模型组比较,P0.05或P0.01。
差别有显著性或差别有极显著性。
小鼠淋巴细胞百分比、CD4+、CD8+T细胞百分比和CD4+、CD8+T细胞的绝对数均高于模型组。
用药组与正常对照组比较,P0.05或P0.01。
小鼠淋巴细胞百分比、CD4+T细胞百分比和CD4+、CD8+T细胞的绝对数均低于正常对照组。
说明造模成功。
并且说明用药后并不能完全恢复。
与复方转移因子低剂量组比较,P0.01。
小鼠淋巴细胞百分比、CD4+、CD8+T细胞的绝对数均高于低剂量组。
说明复方转移因子提高淋巴细胞百分比和CD4+、CD8+T细胞的绝对数并与剂量关系明显。
本课题开展的中药复方干预艾滋病进程作用机制的研究,是利用现代生物技术提取转移因子,在国内外首次将转移因子加入到复方中药中。
进行抗艾滋病治疗的研究。
是现代生物技术与中医中药相结合的范例。
研究中药复方促进艾滋病患者CD4+T细胞增殖及减缓艾滋病的临床进展可能存在的关系,尤其是CD4+T细胞与不同中医治法的相关性。
本研究从转移因子能在体内外可使CD4+T细胞增殖和复方中药抑制HIV二方面,来探讨中药复方减缓艾滋病的临床进展的可行性,开辟了艾滋病临床治疗的新视角,有利于艾滋病临床治疗的进一步深化,并可能为艾滋病患者长期带毒生存提供理论基础。
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