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生物论文
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宁夏大学新华学院
毕业论文(设计)
(2013届)
题目滩羊卵母细胞体外
成熟体系建立
专业生物技术
年级2009
滩羊卵母细胞体外成熟体系建立
摘要
在细胞核移植过程中,体细胞必须在卵母细胞内进行重编程以恢复其全能性,卵母细胞成熟度直接影响体细胞重编程,故卵母细胞体外成熟培养是体细胞核移植极其重要环节,而卵母细胞又受环境,培养液浓度,培养温度等影响。
本实验通过探讨不同浓度的FSH和LH及HMG影响滩羊卵母细胞体外成熟因素的研究,建立滩羊卵母细胞体外成熟体系,为滩羊核移植及以后的优良育种奠定基础。
关键词:
卵母细胞;FSH:
LH;HMG;体外成熟;滩羊
Reprogrammingofsomaticcelldirectly,sothatoocytesinvitromaturationplaysanextremelyimportomtroleinnucleartransplantationofsomaticcell.However,oocytesareaffectedbyenvironment,mediumconcentration,culturetemperatureandsoon;intheresearchwestudiedtheefforeofdifferentdensityFSHandLHandmixtureofFSHandLH,HMGdensity,onoocytesinvitromaturationintansheepandestablishedasystemofoocytesinvitromaturationintansheep,layingthefoundationforadvamcedbreedingandnucleartransplantationoftansheep
Keywords:
vitromaturation;FSH;LH;HMG;tansheep
前言
滩羊是我国独特的裘皮用绵羊品种,是国家二级保护品种,2001年被农业部
列入第一批畜禽品种保护名录。
其所产二毛皮毛色洁白,光泽悦目,花称美观。
滩羊羔羊肉脂肪分布均匀,肉质细嫩,腥味小,是“宁夏羊肉”的代表,已享誉全国。
宁夏是滩羊的主产区,在保护滩羊种质资源特色的同时,对滩羊繁育性能的改良是宁夏滩羊产业发展的共性需求[1]。
动物体细胞克隆技术为动物育种技术开辟了更广泛的途径,必将极大地提高动物育种的效率。
也为我区动物育种产业的发展提过了技术支撑。
在体细胞核移植中体细胞必须在卵母细胞内进行重编程以恢复其全能性,而卵母细胞的成熟度则会直接影响体细胞的重编程。
所以卵母细胞的体外成熟,作为体细胞核移植过程中的一个重要环节被人们关注。
自EdwardsRGMaturation通过体外培养使小鼠、绵羊、猴、猪、牛、人[2]等哺乳动物的卵母细胞在体外获得成熟后,许多科研工作者在卵母细胞的体外成熟上做了大量的工作,通过在卵母细胞体外培养液中添加血清[3]、雌激素[4]、FSH、LH[5]等物质,使哺乳动物卵母细胞体外成熟率得到不断提高。
随着卵母细胞体外培养技术日益成熟,体外成熟的卵母细胞正在广泛应用于体外受精,用于扩繁优良母畜。
宁夏是滩羊的主产区,滩羊产业也是宁夏自治区畜牧业中的支柱产业之一,也是全区最具有发展潜力的优势特色产业。
近几年,由于我区加快了从区外、国外引进优良品种绵羊的速度,这虽然对发展我区养羊业、增加农民收入,确实起到了很大的促进作用,但也使我区的滩羊产业受到了极大的冲击。
一方面,随着外来品种的引进,如何对滩羊繁育性能进行改良,提高其经济效益,增强宁夏滩羊产业的竞争力已成为宁夏滩羊产业发展的共性需求。
在动物育种实践中,杂交、选种、选配等传统的育种方法曾发挥了重要作用,在品种改良、新品种育成、品系繁育和经济杂交等方面均获得了很大的成功。
随着社会的发展,转基因技术、动物克隆技术和胚胎移植技术等现代生物技术突飞猛进,为动物育种技术开辟了更广泛的途径,必将极大地提高动物育种的效率。
这些技术的发展及应用将为推动我区滩羊育种产业的发展奠定坚实的基础。
另一方面,由于我区滩羊保种工作严重滞后,优良纯种的滩羊越来越少,如何有效保护宁夏滩羊的种质资源已十分迫切。
目前,我区的滩羊保种采用的是活体保存的方法,即靠维持一定数量的种群来完成,但受科研资金缺乏等因素的影响,其培育繁殖速率较为缓慢。
而利用体细胞克隆技术,保存每一个体的体细胞就可以完成这一保种工作,当需要时克隆出这些动物就可以了。
这一技术彻底地改变了传统的动物保种方式,将为我国畜禽遗传资源的保护提供强有力的技术支撑。
体细胞克隆技术为我区滩羊的种质资源能够得到有效的保护提供了一条新的途径与思路。
不论转基因技术、动物克隆技术还是胚胎移植技术等都需要卵母细胞的体外成熟。
卵母细胞体外成熟效果的好坏直接影响到随后的技术操作质量及胚胎的发育潜力。
目前,获得成熟的卵母细胞通常有两种:
一种是通过超排来获取母畜成熟的卵母细胞,此方法对母畜的伤害较大,不易经常使用;另一种方法是通过采集卵巢中未成熟的卵母细胞,在模拟体内的生长环境来促使卵母细胞在体外成熟的过程。
这种方法可获得大量的成熟卵母细胞,而且可以选择质量高的卵母细胞。
是目前大型哺乳类动物获得成熟卵母细胞较为常用的方法。
卵母细胞的成熟是一个复杂的、动态的过程,有许多代谢事件发生,除了进行积极的mRNAs转录、蛋白质合成外,还有其他一些物质的降解。
在体外成熟培养中,通常以第一极体的排出来判断卵母细胞的成熟,其实这只是核成熟的标志。
除了核成熟外,卵母细胞的胞质成熟也很重要,尤其是对用于核移植的卵母细胞而言,胞质的成熟直接关系到能否使供体核实现彻底的再程序化、重构胚能否维持正常的分裂发育。
从这个意义上说,目前所用的卵母细胞成熟体系还不尽完善,一些对卵母细胞成熟和后续发育非常重要的物质不能完全合成。
近年来,在卵母细胞体外成熟的研究中,人们的注意力主要集中在提高卵母细胞体外成熟及其支持胚胎发育的能力上。
总体上看,主要包括基础培养液的改进、性激素的添加和其他成分的丰富。
卵母细胞体外成熟中应用最广泛、效果稳定的基础培养液是TCM199。
在牛和猪上,TCM199添加10%血清、促性腺激素和雌激素,活得了90%的成熟率。
小鼠卵母细胞的体外成熟在CZB及K-SOMaa中也可得到很好的效果。
由于血清成分复杂,人们在合成培养液(如SOFM、KSOM)中添加BSA、PVA及氨基酸来替代血清,使卵母细胞成熟并能进行受精后的发育。
激素是卵母细胞成熟培养中的必不可少的成分,特别是促性腺激素,它对成熟的启动发挥主要作用。
FSH和或LH是成熟培养液中使用较多的促性腺激素。
FSH(卵泡刺激素)是调节卵泡发育的一种重要激素,它能促进颗粒细胞加速有丝分裂并分泌卵泡液,从而使卵泡能够成熟排卵。
鉴于在卵泡发育过程中的重要作用,FSH被广泛应用于哺乳动物卵母细胞体外成熟培养,并证实能够促进卵母细胞周围卵丘细胞的扩展。
LH(黄体生成素)可使卵母细胞恢复减数分裂,成熟卵泡分泌前列腺素(PGF2a)。
因排卵前卵泡卵母细胞的成熟分裂恢复与LH峰的时间基本一致,一般认为LH是卵母细胞体内成熟的诱导者。
卵泡体外培养的研究结果亦表明,LH或HCG能诱导卵泡内卵母细胞成熟分裂的恢复。
因此,LH被广泛用于卵母细胞的体外成熟培养,并证实能提高卵母细胞成熟后的胚胎发育能力特别是在无血清的条件下。
此外,eCGTansheepCumulus-oocytecomplexesinvitro
Acontrol;BCumulus-oocytecomplexesofOMⅠ;CCumulus-oocytecomplexesofOMⅡ;DCumulus-oocyte
complexesofOMⅢ
图2:
不同FSH和LH激素浓度卵母细胞的扩增距离
Figure2:
differentFSHandLHofoocytesamplificationdistance
表1不同FSH和LH浓度对滩羊卵母细胞体外成熟的影响
Table1EffectsofFSHandLHonTansheepoocytesinvitromaturation
组别
Group
细胞数
No.ofoocytes
成熟数
No.ofmaturationoocyte
成熟率(%)
Maturationrate(%)
对照组
OMⅠ
OMⅡ
OMⅢ
127
457
434
405
63127
264457
299434
221405
49.6a
57.9b
68.8c
54.6b
a,b,c:
p<0.05;注:
同一列不同上标表示不同组别间差异性,。
Note:
Valueswithdifferentsuperscriptswithinsamecolumnsdiffersignificantly,P<0.05.
在滩羊卵母细胞成熟培养液中添加不相同浓度的FSH和LH对卵母细胞成熟率不同,成熟培养液中加入100μgmLFSH和20μgmLLH成熟率为57.9%,与对照组差异性显著。
添加200μgmLFSH和40μgmLLH的OMⅡ成熟率为68.8%,与对照组差异性显著。
添加300μgmLFSH和60μgmLLH的OMⅢ成熟率54.6%,与对照组差异性显著(表1)。
OMⅡ的成熟率与OMⅠ和OMⅢ的成熟率差异性显著。
该结果说明,成熟液中适度FSH和LH的浓度变化对滩羊卵母细胞体外成熟有着非常重要的影响,过高的激素浓度对卵母细胞的成熟有抑制作用。
2.2HMG对卵母细胞体外成熟的影响
在卵母细胞体外成熟培养液中添加HMG(FSH﹕LH≈1﹕1)可替代FSH和LH激素的添加,不同HMG浓度也可促进COCs的扩散(图3),在培养22h后卵丘细胞扩散直径表现为对照组(图3A)<OMⅣ(图3B)<OMⅤ(图3C)<OMⅥ(图3D)<OMⅦ(图3E)。
随着激素浓度增加扩散直径也在增加,但当浓度大于0.2IUmL浓度时扩散度不再增加。
同样运用imageJ2x软件测定各组成熟液中的卵母细胞扩增距离显示,不加激素的对照组与添加激素的OMⅣ、OMⅤ、OMⅥ、OMⅦ各组中卵母细胞的扩增距离差异性显著。
添加激素的各组之间差异性不显著。
如图4显示。
图3HMG对卵丘-卵母细胞复合体(COCs)扩散的影响(100×)
A.对照组;B.OMⅣ中卵丘细胞的扩散;C.OMⅤ中卵丘细胞的扩散;D.OMⅥ中卵丘细胞的扩散;E.OMⅦ中卵母细胞复合体扩散。
Fig3TheeffectsofHMGonTansheepoocytesmaturationinvitro
A.control;BCumulus-oocytecomplexesofOMⅣ;C.Cumulus-oocytecomplexesofOMⅤ;D.Cumulus-oocytecomplexesofOMⅥE.Cumulus-oocytecomplexesofOMⅦ
图4:
不同HMG激素浓度卵母细胞的扩增距离
Figure4:
ThedifferentHMGofoocyteamplificationdistance
在成熟培养液中添加不同浓度的HMG,卵母细胞的成熟率不同如图(表5)
表5:
HMG浓度对滩羊卵母细胞体外成熟的影响
Table:
EffectsofHMGonTansheepoocytesinvitromaturation
组别
Group
细胞数
No.ofoocytes
成熟数
No.ofmaturationoocyte
成熟率(%)
Maturationrate(%)
对照组
OMⅣ
OMⅤ
OMⅥ
OMⅦ
427
163
672
175
186
213
82
468
84
61
49.8a
50.3a
69.6b
48.1a
32.7c
a,b,c:
p<0.05;注:
同一列不同上标表示不同组别间差异性.
Note:
Valueswithdifferentsuperscriptswithinsamecolumnsdiffersignificantly,P<0.05.
从表5滩羊卵母细胞成熟率可看出:
其中添加0.1IUmLHMG的成熟液的成熟率为69.6%,与对照组差异性显著。
这表明0.1IUmLHMG添加培养液中有利于卵母细胞的成熟。
而随着浓度不断增加成熟率降低,说明过多的HMG对滩羊卵母细胞的成熟有抑制作用。
3讨论与分析
哺乳动物卵母细胞体外成熟培养技术是利用类固醇激素和促性腺激素在体外模拟卵泡的环境,进而诱发卵母细胞成熟的一项实验研究。
在卵母细胞成熟过程中,促卵泡素FSH和出黄体素LH等促性腺激素素具有协同作用,共同调节卵母细胞成熟。
研究表明,在体外成熟卵母细胞培养中FSH能显著提高成熟率,及提高早期胚胎的发育能力。
其中FSH与诱导卵丘扩散、暂时抑制生发泡的存在,改变了减数分裂第一次所需的时间,从而促进了卵母细胞的体外成熟。
LH也有类似作用,LH另一方面通过除去成熟分裂抑制因子激活卵母胞的减数分裂发生[6]。
FSH在卵泡发育中起至关重要的作用,它通过cAMP途径促进卵丘细胞增生并产生相应的LH受体[7]促使卵丘细胞膨散,通过刺激颗粒细胞分泌成熟促进物,直接或间接地作用于卵母细胞,启动卵母细胞成熟分裂[8],将FSH加入培养基中促进人卵母细胞体外成熟,获81%的成熟率[9]。
对于LH,一般认为通过两条途径发挥作用:
一是引起卵丘发生变化,促进卵丘细胞扩散,可以促进颗粒细胞上孕酮受体的表达及孕酮的产生,孕酮通过Connexin43导致生发泡破裂(GVBD)便于精子通过卵丘细胞间隙到达透明带[10];二是显著增强了卵母细胞的存活力,降低异常卵母细胞的数量,从而提高卵母细胞的受精率[11]。
4结论:
本实验结果表明成熟液Ⅰ成熟液Ⅱ成熟液Ⅲ卵母细胞成熟率(68.8-54.6)%,激素FSH和LH的质量浓度分别是10020μgml、20040μgml、30060μgml,在成熟液Ⅰ和成熟液Ⅱ中随着激素浓度增加成熟率呈浓度正相关。
在成熟液Ⅱ和成熟液Ⅲ中随着激素浓度的增加卵母细胞成熟率差异显著。
添加HMG单位浓度在0.1IUmL与0.2IUmL下卵母细胞的成熟率(73.0-53.6)%。
随着激素浓度的增加成熟率下降。
HMG含有1:
1的FSH和LH,已经证明可用来代替FSH和LH用于山羊和牛卵母细胞的成熟培养[12]。
本研究比较FSH和LH配合使用或HMG单独使用时对滩羊卵母细胞体外成熟的影响。
结果表明,200μgmLFSH和40μgmLLH配合使用对卵母细胞的成熟的效果稍差于0.1IUmLHMG添加效果,这与有些研究结果略有不同[13],推断差异可能是由于激素的不同生产厂家造成的。
在本试验条件下,在不添加激素的情况下滩羊卵母细胞同样会获得一定的成熟率。
但在成熟培养过程中添加一定浓度的FSH和LH或HMG对滩羊卵母细胞的第一极体排出有明显的促进作用,但浓度过高也会出现对滩羊卵母细胞成熟率有抑制的表现。
参考文献
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西北农林科技大学博士学位论文.2007.
[13]AlexanderB,CoppolaG,DiBD,etal.Theeffectof6-dimethylaminopurine(6-DMAP)andcycloheximide(CHX)onthedevelopmentandchromosomalcomple-mentofsheepparthenogeneticandnucleartransfer
谢词
本课题在选题及研究过程中得到李勇老师的悉心指导。
并为我指点迷津,帮助我开拓研究思路,精心点拨、热忱鼓励。
本文从材料的收集到撰都是在李勇老师和孙毅学长的关心和鼓舞下顺利进行的。
在段璐,马亚楠的互帮互助下得以顺利进行,这期间尽管李勇老师很忙但它却仍然抽出时间为我修改论文,使我能够顺利的将本文完成。
各位学长学姐也为我提供了不少帮助,他们积极的为我查资料并相互检查错误共同提高。
在我的写作过程中,李勇老师多次指导我论文的写作方法和技巧,教我研究的思路和方向。
在我写作论文的期间,每当我遇到困难和疑惑时,A老师总是一针见血的指出我的不足,帮助我拨开迷雾、跨越困难的鸿沟。
李勇老师始终为人师表,不厌其烦,令我感到无比钦佩。
本文是在李勇老师的精心指导下完成的,在此我谨向李勇老师致以崇高的敬意。
最后,不能忘记我同学们,在论文写作的过程中乃至三年的学习生活里,他们与我朝夕相处,互相讨论,共同进步。
在此我忠心的向所有帮助过我的老师和同学表示感谢!
毕业论文通用格式分类号:
无锡职业技术学院
毕业设计(论文)
题目(团队课题要注明“团队”二字)
英文并列题目
所在团队
答辩委员会主任主答辩人
二零15年3月
毕业设计(论文)开题报告
毕业设计(论文)任务书
年月日
设计类建议格式一:
封面
开题报告
任务书
摘要、关键词(含中英文)
第一章序言
1.1XXX
1.2XXX
……
第二章XXX工艺设计
2.1XXX
2.2XXX
……
第三章XXX参数确定及计算
3.1XXX
3.2XXX
……
第四章XXX夹具设计
4.1XXX
4.2XXX
……
第N-1章XXX
N-1.1XXX
N-1.2XXX
……
第N章结论
小结与致谢
参考文献
毕业设计附录目录:
1.机械加工工艺流程图
2.机械加工工艺过程卡
3.机械加工工艺工艺卡
4.机械加工工艺工序卡
5.被加工零件图
6.夹具装配图
7.夹具零件图
8.其他系统图
9.其他原理图
10.零件三维造型图
11.夹具三维造型图
12.设计(作品)实物图
13.设计(作品)实物
14.开题报告
15.专业翻译材料
16.企业证明
17.与企业合作开发的技术服务合同
18.四技服务项目验收表
19.毕业设计(论文)指导记录表
20.毕业答辩评审表
表2毕业设计(论文)评阅教师评价表
表3毕业设计(论文)答辩记录表
表4毕业设计(论文)答辩评价表
表4毕业设计(论文)综合评价表
设计类建议格式二:
封面
开题报告
任务书
摘要、关键词(含中英文)
第一章绪论
1.1XXX课题的背景及意义
1.2XXX国内外研究现状
1.3XXX技术特点
1.4XXX课题研究的内容
……
第二章XXX系统的总体设计
2.1XXX系统整体方案设计思路
2.2XXX
……
第三章XXX系统的硬件设计
3.1XXX系统硬件设计思路
3.2XXX
……
第四章XXX系统的电路设计
4.1XXX系统电路设计思路
4.2XXX
……
第五章XXX系统的软件设计
5.1XXX系统软件设计思路
5.2XXX
……
第六章XXX系统的监控中心设计
6.1XXX系统监控中心设计思路
6.2XXX
……
第N-1章XXX
N-1.1XXX
N-1.2XXX
……
第N章总结与展望
小结并致谢
参考文献
毕业设计附录目录:
1.XXX系统的总体设计图
2.XXX系统的硬件设计图
3.XXX系统的电路设计图
4.XXX系统的软件设计方框图
5.软件光盘
6.其他系统图
7.其他原理图
8.设计(作品)实物图
9.设计(作品)实物
10.开题报告
11.专业翻译材料
12.企业证明
13.与企业合作开发的技术服务合同
14.四技服务项目验收表
15.毕业设计(论文)指导记录表
16.毕业答辩评审表
表2毕业设计(论文)评阅教师评价表
表3毕业设计(论文)答辩记录表
表4毕业设计(论文)答辩评价表
表4毕业设计(论文)综合评价表
论文版面格式:
无锡市机电五金行业市场调查
(三号、宋体、加粗、居中、1.5倍行距)
摘要:
(小五号,黑体)无锡位于长三角地区,近
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