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IL1b等细胞粘附分子在不同类型脑膜肿瘤组织中的表达及意义
IL1b等细胞粘附分子在不同类型脑膜肿瘤组织中的表达及意义
青岛大学
硕士学位论文
IL--1b等细胞粘附分子在不同类型脑膜肿瘤组织中的表达及意义
姓名:
夏广文
申请学位级别:
硕士
专业:
人体解剖与组织胚胎学
指导教师:
夏玉军
20110528
IL-lb等细胞粘附分子在不同类型脑膜肿瘤组织中的表达及意义
中文摘要
目的通过观察细胞粘附分子等细胞因子在不同性质的脑膜肿瘤组织细胞细胞中的表达情况,探讨肿瘤细胞生长的生物学特征,以期寻找更有效和特异性的方法或手段干预肿瘤细胞的迁延性生长,从而为防治肿瘤转移提供直接的依据。
方法随机取肺癌脑膜转移以及原发性脑膜瘤手术标本各20例,常规石蜡包埋、组织切片,先进行HE染色以证实肿瘤一般组织学特点,再利用免疫组织化学染色的方法,分别观察HMGBl、CXCR4、IL.1b以及VCAM.1在各肿瘤组织细胞中的表达,并利用图像分析技术半定量比较光吸收密度的差异。
结果两组组织均可见HMGBl、CXCR4、IL.1b以及VCAM.1的表达。
图像分析技术光吸收密度值,在原发性脑膜瘤组织HMGBl、CXCR4、IL.1b以及VCAM.1分别为0.2406±0.0937、0.2392±0.2346、0.2172±0.0072、0.2112±0.0034;而肺癌脑膜转移组的表达情况分别为
0.3170±0.0021、0.5836±0.0085、0.2715±0.0124、0.3080±0.0097。
肺癌脑膜转
移组HMGBl、CXCR4、IL-lb以及VCAM-l均比原发性脑膜瘤明显增高。
统计学配对资料的t检验,P值均 结论与原发性脑膜瘤相比,肺癌脑膜转移组HMGBl、CXCR4以及VCAM.1表达明显增高;细胞粘附分子HMGB1、CXCR4、VCAM.1的高表达可能是导致恶性肿瘤细胞浸润性生长和迁延性生长的重要细胞粘附分子。 关键词: 原发性脑膜瘤;肺癌脑膜转移;ItMGBl;CXCR4;IL.1b;VCAM.1 ExpressionandSignificanceofAdhesionMolecules,SuchasHMGBl,etc.inprimarymeningiomasandcarcinomatousmeningitissecondarytolungcancerAbstract objective: Theexpressionofadhesionmolecules,suchasHMGB1,CXCR4,IL-lbandVCAM一1inprimarymeningiomasandcarcinomatousmeningitissecondaryto lungcancel"weremeasuredwitllimmunohistchemistry.Therelationwereapproached betweentheexpressionofadhesionmoleculessuchasHMGBl,CXCR4,IL-lbandVCAM-1withinvasivegrowthofdifferenttypemeningiomas.Thepurposeistoinvestthebiologicalcharacteristicofbenighandmalignanttumorsandtofindthespecificandeffectivemethodstointerfereinthemetastasisofmalignanttumors.Method: 20casesoperationalspecimensofcarcinomatousmeningitissecondarytolungcancermatewith 20casesofprimarymeninx"omasrandomly.TheexpressionofHMGB1,CRCX4,IL-lb,andVCAM一1intwogroupsweremeasuredrespectivelywithimmunohistehemistry,andcomparedsemi-quantitativelytothedifferenceof photoabsorptiondensityintwogroupsbyimageanalyticaltechnique.Results1.TheexpressionofHMGB1,CXCR4,IL—lbandVCAM一1aredifferentinthetwogroupsofcarcinomatousmeningitissecondarytolungCanCerandprimarymeningiomas.TheexpressionofHMGB1intwogroupsarerespectively0.2406-a: 0.0937and 0.3170-a: 0.0021(P 0.0085(P<0.05);IL·lbarerespectively0.21724-0.0072and0.2715+0.0124(P<0.05);VCAM一1.arerespectively0.2112+0.0034and0.3080士0.0097(P<0.05).T-testofpairingdataisadoptedtostatisticanalysisandP<0.05ispresumedtostatisticalsignificanceofthedifference.ThedifferencesbetweentwogroupsonexpressionofHMGB1,CXCR4,IL-lbandVCAM-1wereallconsideredasstatisticalsignificanceofthedifferences.ConclusionComparingtoprimarymeningioma,theexpressionofHMGB1,CXCR4,andVCAM-1inthecasesof carcinomatousmeningitissecondarytolungcanceraresignificantlyhigh.Invasive growthoftumorcelliscloselycorrelatedwiththeexcessiveexpressionoftheadhesionmoleculessuch舔HMGB1,CXCR4,VCAM-1.TheexcessiveexpressionoftheadhesionmoleculessuchasHMGB1,CXCR4,VCAM-1ismaybecorrelatedwiththeunnormalexpressionofIL—lb.TheexcessiveexpressionoftheadhesionmoleculessuchaSHMGB1,CXCR4,VCAM一1mayberesultintheinvaeivgrowthofmalignanttumor.If themechanismofactionoftheseadhesionmoleculesaredeeplyresearchedand illuminateclearly,inthefuturethosemaybebecomeimportanttargetstocuremalignant tumors. Keywords: Primarymeningiomas;Carcinomatousmeningitissecondarytolung cancer;HMGBl;CXCR4;IL-lb;VCAM一1. 引言 IL一1b等细胞分子在不同类型脑膜肿瘤组织中的表达及意义引言 脑膜瘤的发生率为2/10万,占同期原发肿瘤的19.2%,仅次于胶质瘤。 大部分为良性肿瘤,仅少数为不典型性和恶性n1。 随着CT、MRI技术的进步,脑膜瘤的检出率明显增高,尤其是无症状脑膜瘤。 脑膜瘤的发生并非单一因素造成,而是与一定的基因变异和内环境改变有关。 某些病理因素,如颅脑外伤、病毒感染、外伤性照射等,有可能使细胞染色体突变、细胞分裂速度加快。 脑转移瘤目前已经超过原发颅内肿瘤,成为最常见的颅内肿瘤‘21。 肺癌脑转移被认为是脑转移瘤中最常见的,脑转移的部位与该区血液供应量及组织体积有关,大脑中动脉分布区是转移癌发生率较高区域。 脑膜瘤细胞的一系列内在特性,包括对免疫细胞攻击的敏感性、生长速率、黏附性、移动性、分泌水解酶和血管生长因子等决定原发肿瘤中特定细胞迁移能力的获得。 迁移细胞表面分子在肿瘤侵入和迁移过程中发挥重要作用。 此外,肿瘤细胞表面的黏附分子,同样可以增加同源的肿瘤细胞团块形成的程度,增加其在循环系统中的存活力。 为探讨肿瘤细胞迁延性生长的生物学特性,我们设计应用免疫组织化学的方法,观察原发性脑膜癌与转移性脑膜癌组织中细胞粘附因子HMGBl、CXCR4、IL-lb以及VCAM.1的表达,探讨以上细胞粘附分子对不同性质的肿瘤细胞迁延性生长的意义,旨在研究良恶性肿瘤的生物学特征,以期寻找更有特异性和有效的方法和手段干预恶性肿瘤的转移。 青岛大学硕十学位论文 第一章材料和方法 1.1研究对象 随机抽取烟台山医院、青岛大学附属毓璜顶医院2008年1月~20lO年12月肺癌脑膜转移的手术标本20例,与同期原发性脑膜瘤的手术标本20例配成对子。 排除标准: 并发除肺癌外的其他恶性肿瘤及自身免疫系统疾病者。 1.2主要实验仪器 石蜡切片机科迪150浙江金华科迪仪器有限公司 台式保温箱PW/10.002重庆仪器厂 ADVENURETM电子天平上海奥豪斯公司 OLYMPUS,BXS0,PM一20日本 三用电热恒温水浴箱上海跃进医疗器械厂 海信冰箱青岛海信股份有限公司~ SHA—C水浴恒温振荡器浙江恒丰仪器厂 雷磁PHS-3C型精密PH计上海精密科学仪器有限公司 海信微波炉青岛海信股份有限公司 SimplePCI图象分析系统美国 HJ4多头磁力加热搅拌器江苏荣华仪器制造有限公司 隔热式电热恒温干燥箱山东潍坊医疗器械厂1.3主要实验试剂 S—P法免疫组化试剂盒北京中山生物工程公司 多聚赖氨酸北京中山生物工程公司 HMGBl兔单克隆抗体北京中山生物工程公司 VCAM一1兔单克隆抗体北京中山生物工程公司 IL—lb兔单克隆抗体北京中山生物工程公司 CXCR4兔单克隆抗体北京中山生物工程公司 DAB显色剂北京中山生物工程公司1.4主要试剂配制 (1)4%多聚甲醛(PFA)溶液(pH7.3)常规配制 (2)0.01MPBS(pH7.2-7.4) Na2HP04.12H2049 NaH2P04·2H200.49 NaCl99 2 第一章材料和方法 加双蒸水至1000mL,室温保存(3)二甲苯、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。 (4)Harris氏苏木素 A液苏木素59,无水乙醇50mLB液钾明矾(硫酸钾铝)1009,蒸馏水1000mL 先将A液用玻璃棒搅拌使苏木素溶解,再将B液煮沸溶化,速加入A液,去火,立即加入氧化汞(约O.59),再煮沸,迅速冷却后加入冰醋酸8mL过滤使用。 (5)0.01M枸橼酸盐缓冲液 枸橼酸三钠(C6HsNa307·2H20)39枸橼酸(C6H807·H20)0.49 加双蒸水至1000mL,4"C保存1.5主要实验方法 1.5.1取材 在手术过程中,切取原发性脑膜瘤和肺癌脑膜转移肿瘤组织各20例,将切取的组织经生理盐水反复冲洗后,分别标记,入多聚甲醛溶液固定。 常规石蜡包埋,备用。 1.5.2切片制备 用于免疫组化的载玻片先置浓硫酸中先浸泡24小时,然后自来水流水冲洗过夜,再用双蒸水浸泡、冲洗3遍,烤箱中干燥后,均匀涂以多聚赖氨酸,置于45。 C烤箱中烘干备用。 将各组织蜡块以7pm的厚度连续切切片,标记清楚。 分别取原发性脑膜癌和肺癌脑膜转移各1.2张切片行HE染色,其余进行免疫组化染色。 1.5.3HE染色步骤 (1)将准备好的石蜡切片脱蜡水化。 (2)切片由水中转入苏木素酒精溶液染色10min。 (3)l%盐酸酒精分色20see。 (4)l%氨水溶液返蓝,自来水冲洗15min。 (5)l%伊红水溶液复染5min。 (6)梯度酒精脱水,分色。 (7)二甲苯透明。 (8)中性树胶封固。 在光学显微镜下观察不同组别组织的形态学变化。 1.5.4免疫组化染色步骤 (1)将备好的切片置于56。 C烤箱中烤片,待切片上出现蜡滴即可(约10min)。 青岛大学硕士学位论文 (2)脱蜡,水化(本过程<20rain)。 (3)3%过氧化氢灭内源酶,室温15--20rain。 (4)蒸馏水洗3次,每次5min。 (5)微波修复: 将切片浸入加满0.01M枸橼酸盐缓冲液的染色缸内,放入微波炉中加热,待温度达到90。 C停止加热,并维持在此温度30min,然后自然冷却。 (6)0.01MPBS洗3次,每次5min。 (7)加羊的非免疫血清,37℃恒温水浴箱20rain。 (8)甩干不洗,分别给各组切片加HMGBl、CXCR4、IL.1b以及VCAM一1 人单克隆抗体(1: 200),实验组的阴性对照不加一抗,置于37℃恒温水浴箱90min。 (9)0.01MPBS洗3次,每次5min。 然后滴加即用型二抗,置于37。 C恒温水浴箱40rain。 (10)0.01MPBS洗3次,每次5min。 滴加即用型SABC,置于37℃恒温水浴箱30rain。 (11)0.01MPBS洗3次,每次5min。 .(12)DAB显色,镜下控制显色时间。 (13)脱水,透明,封片。 1.5.5免疫组化阳性细胞结果观察HMGBl、CXCR4、IL.1b以及VCAM—l均表达在染色阳性细胞的胞浆或胞膜呈 现程度不同、基本均匀的棕黄色颗粒。 免疫组化染色结果半定量分析: 利用美国SamplePCI图象分析系统进行光吸收 密度测量分析,将免疫组化染色结果转化为光吸收密度值。 每张切片以组织间质空 白处入射光的值为定标。 每张切片测定每个阳性细胞的光吸收密度取平均值,以其作为切片的测定值。 1.6统计学处理应用SPSSl7.0统计学软件,采用配对资料的t检验,分别计算两组HMGBl、 CXCR4、IL.1b以及VCAM.1表达的t检验,取Q=o.05为检验水准,P<0.05表示差异有统计学意义,若P>0.05表示在a=0.05的检验水准下,差别无统计学意义。 4 第二章结果 第二章结果 2.1原发性脑膜瘤与对肺癌脑膜转移HE染色结果分析符合两种肿瘤的一般组织病理学特征(图l,2)。 2.2HMGBl染色结果分析HMGBl的表达在染色阳性细胞的胞浆或胞膜,呈现程度不同、基本均匀的棕黄 色颗粒。 肺癌脑膜转移组织中可见较明显的HMGBl表达(图3);原发性脑膜瘤组织表达不明显(图4)。 利用SamplePCI图象分析系统进行半定量分析,结果见表1,经统计学比较,P≤O.01,差异有高度的统计学意义。 2.3CXCR4染色结果分析CXCR4的表达在染色阳性细胞的胞浆或胞膜,呈现程度不同、基本均匀的棕黄 色颗粒。 肺癌脑膜转移组织中可见较明显的CXCR4表达(图5);原发性脑膜瘤组织表达不明显(图6)。 利用SamplePCI图象分析系统进行半定量分析,结果见表1,经统计学比较,P≤0.01,差异有高度的统计学意义。 2.4VCAM.1染色结果分析VCAM.1的表达在染色阳性细胞的胞浆或胞膜,呈现程度不同、基本均匀的棕 黄色颗粒。 肺癌脑膜转移组织中可见较明显的VCAM.1表达(图7);原发性脑膜瘤组织表达不明显(图8)。 利用SamplePCI图象分析系统进行半定量分析,结果见表1,经统计学比较,P≤O.01,差异有高度的统计学意义。 2.5IL.1b染色结果分析IL.1b的表达在染色阳性细胞的胞浆或胞膜,呈现程度不同、基本均匀的棕黄色 颗粒。 肺癌脑膜转移组织中可见较明显的IL.1b表达(图9);原发性脑膜瘤组织表达不明显(图10)。 利用SamplePCI图象分析系统进行半定量分析,结果见表1,经统计学比较,P≤0.01,差异有高度的统计学意义。 表1实验组、对照组的组织HMGBl、CXCR4、IL.1b以及VCAM.1的表达光吸收密度测量结果(x±s) 统计学分析采刚配对资料的t检验,分别计算实验组和对照组HMGBI、CXCR4、IL-lb以及VCAM.1表达的t检验,取a=0.05为检验水准,P<0.05表示差异有统计学意义,若P>0.05表示在Q=0.05的检验水准下,差别无统计学意义。 本实验结果中所得实验组与对照组的数据,经统计学分析,均为P≤O.01,表示差异有高度的统计学意义。 5 青岛人学硕士学位论文 附图: 图1脑膜瘤HE染色结果(200×) 图2肺癌脑膜转移HE染色结果(200×) 6 第二章结果 图3脑膜瘤组织细胞HMGBl免疫组化染色结果(200×) 图4肺癌脑膜转移瘤组织细胞HMGBl免疫组化染色结果(200×) ——青岛人学硕士学位论文 ——————————————————————————二——二l二二二=二=—一. 图5脑膜瘤组织细胞CXCR4免疫组化染色结果(200×) 图6肺癌脑膜转移瘤组织细胞CXCR4免疫组化染色结果(200x) 第一二章结果 图7脑膜瘤组织细胞VCAM.1免疫组化染色结果(200×) 图8肺癌脑膜转移瘤组织细胞VCAM.1免疫组化染色结果(200X) 9 ———————————————————————————————————————————————————————————一一..童鱼盔堂堡主堂垡笙茎—— 图10肺癌脑膜转移瘤组织细胞IL.1b免疫组化染色结果(200×) 10 第三章讨论 第三章讨论 3.1脑膜瘤的一般流行病学 3.1.1一般概况: 脑膜瘤(Meningiomas)尸体的解剖发生率为30%,恶性脑膜瘤为O.17/10万,是起源于脑膜及脑膜间隙的衍生物,大部分来自蛛网膜细胞,也可以发生于任何含有蛛网膜成分的地方,例如脑室内脉络丛组织,也可能来自硬膜成纤维细胞和软脑膜细胞。 在颅内肿瘤中,其发生率仅次于胶质瘤,为颅内肿瘤中最常见者,占颅内 肿瘤的15%--24%(平均为19%)[3410脑膜瘤在儿童中少见,儿童发生率为0.3/10万, 16岁以下不及1.3%,而且男孩占优势1351。 发病年龄以中老年为主,其中女性多于男性,为2: 1。 随着CT、MR技术的进步,脑膜瘤的检出率明显增高,尤其是无症状脑膜瘤。 大部分属于良性肿瘤,仅少数为不典型性和恶性‘361。 脑膜转移瘤又被称 为脑膜癌病、癌性脑膜炎,早期被认为是恶性肿瘤相对少见的晚期表现之一p“.最近几年,随着肿瘤患者生存期的延长以及cll、MR等影像学的发展,脑膜病变的检出 率越来越高。 3.1.2病因: 与其他肿瘤一样,脑膜瘤的病因尚不完全清楚。 可能与一定的内环境改变和基因变异有关,并非单一因素造成的。 可能与遗传因素、外伤、放射线、病毒感染等有关。 但目前各种各样致癌因素的实验研究,只能造成恶性脑膜瘤。 目前细胞分子生物学的研究已证实脑膜瘤的染色体是异常的。 最常见的基因改变是染色体22q12 上NF2抑癌基因突变,大约半数以上脑膜瘤患者有22q12等位基因缺失[3810大多数认为,脑膜瘤的基因在22染色体长臂,位于肌球蛋白与原癌基因SIS之间。 它是一 种抑癌基因,因此,瘤细胞内单体型22染色体丢失,继之发生随机事件或此肿瘤抑 癌基因发生突变,引起细胞失控生长,导致脑膜瘤的发生。 脑膜瘤肿瘤血供丰富,常与脑组织有明确的边界,接受来自颈内动脉和颈外动脉系统的双重血供,脑血管造影常有典型的表现,对定性诊断有决定性意义。 青岛大学硕士学位论文 3.1.3临床表现: 临床表现的多样性及复杂性是由其不同的位置、大小及生长速度导致,如压迫或脑组织与颅骨的反应性改变、对邻近结构的直接侵袭及其所造成的脑脊液循环途径、静脉寞、皮质静脉的梗阻。 患者可出现头痛、呕吐、恶心及视乳头水肿等颅内压增高症状,由于瘤体相当大或瘤体虽小但其生长速度快时,反应性血管源性水肿在瘤周出现,肿瘤对局部脑组织或颅神经的压迫引起局灶性症状各异。 一般病史较长,其主要的临床表现为头痛、精神障碍、肢体运动障碍等;在优势半球可致语言 障碍,但相对而言,一般脑膜瘤所导致的临床症状并不如胶质瘤那么常见p"。 CT和MR[是目前诊断脑膜瘤的主要手段。 MRI观察肿瘤的基底部比CT优越,在形态学 上优于CT,MRI无骨伪影,所以它能更清楚地显示肿瘤与脑组织间的界面、与脑膜 的关系及被神经血管的包绕情况。 脑膜转移瘤好发于中老年,主要表现如头痛、恶心、呕吐、性格改变等脑、颅 神经及脊神经受侵组病状以及颅内压增高引起的一系列反应。 一般而言,脑膜转移是恶性肿瘤的一种少见临床表现,但近几十年来,国内外报道的发病率有上升趋势。 目前文献报道肺癌脑膜转移发病率大约为5%,小细胞肺癌为9%---25%,恶性黑色 素瘤为23%(371。 因为脑膜转移与脑转移症状和体征不易区分,所以当实体肿瘤患者出现头痛或意识障碍等神经症状时,不但要考虑到脑转移,同时应考虑到脑膜转移。 3.1.4治疗方法: 手术治疗是治疗脑膜瘤最直接、最有效的方法。 早在18世纪,已经开始采用手术治疗脑膜瘤,并在1887年首次成功切除脑膜瘤。 Simpson等nu根据外科切除质量与脑膜瘤复发率的关系,提出以肿瘤切除程度将手术质量分为5级: 1级,肿瘤 完全切除,包括受累硬膜与颅骨;2级,肿瘤完全切除,电凝烧灼附着的硬膜;3级, 肿瘤肉眼完全切除,但未切除或电凝烧灼硬膜(比如一些主要的静脉窦);4级,肿瘤次全切除;5级,单纯减压术和/或活检。 由于脑膜瘤的原发部位不同,所累及的不仅有硬脑膜,还有硬膜窦、颅神经、颅骨、邻近的血管和脑组织等,随着神经外科显微技术有了长足的进展,有时达到次全切除更为安全和现实。 第三章讨论 尽管大部分脑膜瘤的手术效果是令人满意的,但对于生长于颅脑中线和颅底部
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