高通量测序原理.ppt
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高通量测序原理.ppt
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IlluminaSolexa合成测序基本原理,李珊珊21620101152311,Solexa技术介绍,Solexa技术最早由两位剑桥大学的化学家创立,利用专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结”,达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。
Solexa的基本原理,扩增,“桥”结构,单链引物,DNA簇,单分子克隆,1000DNA片段per1m“DNA簇”1000“DNA簇”per100msquare40millionclustersperexperiment,准备DNA片段,两端接上adapters,将DNA片段通过adapter锚定在芯片上,循环扩增DNA片段成“DNA簇”,检测,可逆终止反应ReversibleTerminatorChemistry,4种标记过的核苷酸,Sequencing-by-Synthesis(SBS),掺入一个碱基,Cycle1:
加入反应体系,移除其他未掺入的核苷酸,信号检测,Cycle2-n:
加入反应体系,循环cycle1,1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP,末端带有可以被去除的保护基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸,仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束,用化学方法去除阻断基团和荧光基团,进行下一轮测序反应,TTTTTTTGT,TGCTACGAT,根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列,转换成相应的DNA序列,通过荧光信号分析核苷酸序列,优缺点,高度自动化的系统读取片段多,适合进行大量小片段的测序,如microRNAprofiling基于可逆反应,随反应轮数增加,效率降低,信号衰减,读取序列较短,给从头测序(denovosequencing)拼接带来困难,技术特色突出表现,每张测序芯片有8个通道,每个通道可单独运行一个样品,也可以把多个样品混合在一起检测;一次实验可读取大于15亿个碱基/芯片;无需建库,自动化样品制备,简单;实验费用低,测序成本为传统测序方法的1/100;样本使用效率极高,所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测。
应用,测序与重测序表达谱分析SmallRNA鉴定与定量SNP检测DNA甲基化分析,
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- 通量 原理