酶活测定方法.docx
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酶活测定方法
还原法
酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法
通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法
该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常
情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法
酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法
常用于酶活性分析的免疫学方法包括:
免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法
将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定
随着生物技术的发展及环保要求的提高,越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水,脱毛,软化,脱脂等工序都用到大量的酶制剂,从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶的本质是蛋白质,所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中,由于条件的变化、振荡、阳光等的作用,其活力要有所改变,故在使用之前必须测定其活力。
作为计算酶制剂用量的依据,以达到预期的脱毛效果。
即现测现用。
酶的活力是指酶催化底物进行反应的本领。
即酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的底物越大,则催化速度越快,活力越高。
酶活力的大小用酶活力单位(U,activeunit)来表示。
1961年国际酶学会议规定:
1个酶活力单位是指在特定条件(25℃,其它为最适条件)下,在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量,或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
1979年国际生物化学协会为了使酶活性单位与国际单位制(SI)的反应速率相一致,推荐用Katal单位(也称催量,Kat)。
规定为:
在最适条件下,1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。
Kat和U的换算关系:
1Kat=6×107U,1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat。
把酶制剂的量和活力联系在一起,即为酶的比活力,它表示单位质量的蛋白质中所含的某种酶的活力单位的多少。
是用来度量酶纯度的指标。
在实际生产中所说的酶活力一般是指酶的比活力大小。
另外在实际的生产应用中,由于酶的性质不同,测定方法不同,很多酶的活力都有各自的惯用单位。
1、Folin法(第一法)测定蛋白酶活力
目前所用到的蛋白酶的种类比较多。
根据每种酶作用的条件不同,主要是最适PH值不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。
在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。
定义:
lg固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH值条件下,lmin水解酪素产生lμg酪氨酸为一个酶活力单位,以U/g(U/mL)表示。
具体测定方法见《QB/T1803-1993工业酶制剂通用试验方法》及《SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法》。
表1几种酶促反应最佳条件
2、胰酶活力测定
胰酶系从各种动物胰脏制取的混合物,主要是蛋白酶,脂酶和淀粉酶。
白色或淡黄色无定形粉末,有微弱的肉类物臭味。
溶于水呈微浑溶液,不溶于醇和醚。
遇酸、碱及热即丧失活力,pH=7.8~8.7活性强。
水溶液遇酸、热、重金属或单宁酸时产生沉淀,经煮沸则迅速分解而变性。
胰酶用于原料皮脱灰后进行软化。
胰酶中所含的弹性蛋白酶,可以分解弹性蛋白质,防止成革粒面出现碎玻璃花纹,提高产品质量。
胰酶软化时,对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解,可除去皮内残存的脏物、毛根分解产物、纤维间质等,有利于皮纤维进一步分散,促进躁剂与皮胶原的结合,以使成革具有柔软性、丰满性和良好的透气性。
酶软化是制造软革很重要的操作,但胰酶浓度过高,皮内胶原纤维损失大,致使成革松面。
为了达到正常的软化目的,必须在软化之前,测定其活力,以便确定其含量。
[醋酸盐指示剂法]
(1)测定原理胰酶能催化酪蛋白水解,而且胰酶量越多,被水解的酪蛋白就越多。
一定量的胰酶,催化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多,其胰酶的活力越大。
与福林法蛋白酶活力不同的表示是,胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。
即在一定的pH值和时间内1g胰酶能使酪蛋白完全水解的质量(g),即胰酶能使酪蛋白转化的能力,又称酪蛋白转化力,以倍数来计量。
控制胰酶的最适条件pH=8~9、T=(40±1)℃,用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用,水解一定的时间后,用醋酸盐(或醋酸)指示剂调节反应液pH值达到酪蛋白的等电点(pH=4.6)附近,末被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出,而水解产物则不沉淀。
据此,则可找到恰好使定量的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。
根据胰酶的体积和浓度,即可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数,即胰酶的活力。
(2)试剂1.24:
50硼酸水溶液;0.1mo1/L。
NaOH水溶液;硼酸盐溶液,即1.24:
50的H3BO420mL+2mL0.1mo1/LNaOH;13.6%醋酸钠水溶液;60%醋酸溶液;醋酸盐缓冲液,即l3.6%NaAc与60%HAc等体积混合。
(3)操作
①配制底物酪蛋白称取(精确至0.0001g)0.2g细酪蛋白于小
烧杯中,加20mL蒸馏水,移取5mL0.1mo1/LNaOH,40℃水浴上加热约30min,搅拌使之溶解,移人100mL容量瓶,加5mLH3BO4溶液,并定容到刻度(pH=8.5)。
②胰酶溶液的配制在研钵中称取(精确至0.0001g)胰酶0.1g(先加3~5滴研磨,再补加15~17滴),加1mL硼酸盐溶液,浸泡3~5min,研磨到无大块胰酶,转移定容到500mL容量瓶,用H2O定容。
③粗测取5支带刻度的干燥试管,按表1-2所示进行。
依次滴加醋酸盐缓冲液0.5mL(10滴),边滴边观察刚加人时是否产生白色沉淀,若缓冲溶液到了试管底部还不出现沉淀,说明酪蛋白已水解完全,有沉淀产生,证明酪蛋白没有全部水解,找出刚不产生沉淀的胰酶体积(mL)。
即是5mL酪蛋白完全水解的最少胰酶量。
表2胰酶活力粗测步骤
表3胰酶活力精确测定步骤
(4)计算胰酶活力X按照下式计算。
式中ml——酪蛋白的质量,g;
m2——胰酶的质量,g;
V——终点时管中胰酶溶液的体积,mL。
(5)注意事项:
①酪蛋白、胰酶、水按比例加入以后一定要使其混合均匀,否则将造成试管底部的酪蛋白没有水解,使测定结果不准确。
②水浴加热,使整个液面都进入到水中。
③试管的粗细程度。
试管不可太粗或太细,既好摇匀又好观察,且粗细一致。
④配制好的胰酶和酪蛋白溶液在室温20℃以下存放24h有效,室温高于20℃时胰酶4h有效,酪蛋白8h有效。
⑤产生白色沉淀必须是现加现看,不能放置过久,否则酪氨酸也沉淀出来了。
3.l还原糖法(Reducingsugarrelease)
这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来进行的。
酶与底物在特定的条件(温度、PH值和底物浓度)下反应。
反应产物是还原糖,通过比色确定还原糖的数量,同时制作标准曲线。
酶的活性表示为每分钟产生lmmol的产物所需要的酶量(mg或ml)。
3.2比色法(ColorimetricassaysⅠ)
这种方法是对底物进行化学修饰,使其带有特定的可溶性生色基团物质,该生色基团能够产生特定颜色。
在酶与底物发生反应后,生色基团就被释放出来,用分光光度计可以测定颜色的深度,并制作标准曲线。
与已知标准酶的活性进行比较,计算出该酶的活性。
这种方法并不能区分内切酶和外切酶,但是通常认为这种方法更适合于测定外切酶。
目前采用这种方法测定所需的底物被工业上广泛采用。
3.3比色法(ColorimetricassnysⅠ)
这种方法是通过生色基团结合酶作用底物分子的中间产物(sub-unit)来确定酶的活性。
如PNPG(paranitrophenyl),该种物质与半乳糖结合形成一种乳糖(或葡萄糖)类似物。
在酶的作用下,释放出PNP,利用其它方法测定PNP的含量。
上述的方法通常只在生物化学实验室采用,饲料酶作用的底物是高分子量的物质,不宜采用。
3.4黏度法(Viscometricassays)
这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物(控制pH值、温度等条件)的黏度的能力来确定酶的活性。
利用的底物主要有化学合成的底物(如CMC用于纤维素酶的测定)和自然提取的底物(如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定)。
测定的酶的活性值是通过与同时测定的标准酶活性的比较,来确定酶的活性。
这种方法的特点是通过降低底物的新度来反映酶的活性,这也正是酶在体内起作用的重要特征。
化学合成的底物的效果要优于自然提取的底物,因为化学合成的底物不利于酶的接触。
3.5免疫学法(Immunologicalmethods)
用于酶活性分析的免疫学法包括ELISA法和免疫凝胶扩散法。
这两种方法是根据酶与抗体之间发生反应,然后ELISA法通过第二步反应,凝胶扩散法则通过印染过程来确定酶的活性(与标准添加酶的水平对比)。
这些方法是非常灵敏的,能够检测到极低水平的酶蛋白。
但它们的缺点是对于每个产品的酶需要特殊的抗体,另外作为抗体能够与非酶蛋白质发生反应。
由于抗体本身所用的蛋白质是特定的,因此,由不同生产者生产的同种类型的酶之间是没有交叉性的。
另外,采用实验动物的敏感性也值得探讨。
3.6凝胶扩散法(GelDiffusionmethods)
这种方法是将酶作用的底物与某种凝胶混合后倒入培养皿中,凝固之后,在凝胶上切开一条凿,倒入标准酶液和测试酶液。
培养一定时间后,在切开的凝胶周围能够看到水解区域,区域的大小与酶的含量成比例。
在某些情况下,还可以再加入其它试剂来显示水解的区域。
这种方法虽然简单,但培养时间长,一般需要一个晚上。
因为这种方法是根据区域的大小来确定酶的活性,所以其准确性要低于其它非扩散的方法。
但它们的优点在于简单、易操作,不需要复杂的装置,这对于饲料厂来说是适用的。
4饲料中酶分析存在的问题
综上所述,上述方法都可以用来检测饲料中酶的活性。
但在对饲料酶活性的分析方法中,需要对以下几个方面进行深入的研究:
4.l饲料酶是由各种微生物产生的,具有各自不同的特性(如底物的亲和性,最佳温度和pH值)。
为了检测某种酶的活性,需要找到一种酶的分析方法,该方法能够测定不同来源的该种酶的活性,但需要对测定条件进行修改。
4.2饲料中酶活性的检测方法没有被普遍接受的一个重要原因就是从饲料中提取酶的方法没有统一,即不能确定从饲料中提取的酶全部是活性酶蛋白质还是部分与饲料结合。
研究表明,纤维素酶能够与饲料结合,而其它酶与饲料结合的可能性要低一些。
4.3饲料酶和其它工业用酶制剂一样,并不是单一的酶。
在分析饲料中某种酶的活性时,如何消除其它酶对测定结果的影响,尤其是测定方法比较接近的两种酶,(如同采用还原糖方法测定纤维酶和木聚糖酶)仍然需要进一步探讨。
4.4酶活性的体外分析法并不能用来评价酶在体内的作用。
酶活的分析方法主要是用于产品的质量的控制,说明目前的使用的产品质量情况。
应该在酶的体外评定法和体内法之间建立某种联系,以便能够通过体外的方法来预测酶在体内发挥的作用。
但到目前为止,酶产品中,还没有一个酶的生产和销售厂家能够提出一种预测酶在体内的功能的方法。
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