蛋白质测定.ppt
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蛋白质测定.ppt
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第四节蛋白质的测定,氮是发酵微生物所必须的氮源。
原料中蛋白质含量的高低对发酵制品的质量关系很大。
氮是蛋白质必含的组成元素,其含量随蛋白质种类而有所差异,但平均含氮量为16%左右。
样品中的蛋白质量可由含氮量乘上一个合适的蛋白质换算系数来求得,这个系数决定于物质中存在的蛋白质的含氮量。
一、蛋白质的测定方法,1.利用蛋白质的共性的方法,如定氮法、双缩脲法、物理法等;2.利用蛋白质中特定氨基酸残基测定蛋白质含量,如Folin-酚试剂反应、染料结合反应等。
最常用和最基本的方法是测定总氮量,再由总氮量计算蛋白质含量。
其中凯氏法是测总有机氮的最准确和操作最简单的方法之一。
二、凯氏定氮法,凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一,可用于所有动、植物样品的分析,可同时测定多个样品,是个经典分析方法,至今仍被作为标准检验方法。
用凯氏定氮法测得的蛋白质为粗蛋白质(包括非蛋白质氮)。
经典和改良的凯氏定氮法,凯氏定氮法分为经典凯氏法和改良凯氏法经典的凯氏法是将数量较多的样品经消化后直接蒸馏,用硫酸标准液吸收,以甲基红做指示剂,用标准碱液滴定。
改良的凯氏法采用水蒸气蒸馏,采用硼酸做吸收剂,并且用甲基红溴酚绿或甲基红次甲基蓝混合指示剂,反应灵敏。
改良的凯氏法根据设备和样品数量的不同,又分为常量法、微量法和半微量法。
常量法的装置简单,准确度高,但试剂消耗较多;微量法和半微量法需要有专用的蒸馏器,但用同一装置可连续检测若干待测液,使用时比较简便。
(一)原理,样品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而氮转化为氨。
分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵,然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸溶液吸收后,再以硫酸或盐酸标准溶液滴定。
根据标准酸液的消耗量得到含氮量,乘以换算系数,即为蛋白质的含量。
1.消化,H2SO4SO2+H2O+O2CH3CHNH2COOH+2O2CH3CHOHNH2+2CO22CH3CHOHNH2+10O4CO2+2NH3+4H2O2NH3+H2SO4(NH4)2SO4总反应式为:
2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O,2.蒸馏,样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出NH3:
(NH4)2SO4+2NaOHNa2SO4+2H2O+2NH3,3.吸收与滴定,NH3+H3BO3H3BO3NH3(NH4+H2BO3-)或2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O吸收液用标准盐酸溶液直接滴定:
H3BO3NH3+HClNH4Cl+H3BO3该法用于微量和半微量凯氏定氮。
(二)操作与注意事项,1.消化
(1)样品应是均匀的;
(2)样品放入凯氏烧瓶内时不要沾附在瓶颈上;(3)在整个消化过程中不要用强火,保持和缓的沸腾,以免氮的损失;(4)消化要在通风橱中进行;,(5)凯氏瓶内消化液体积不可蒸至少于原来的2/3,更不可蒸干,发现损失较多时要补加硫酸。
(6)消化时间视不同样品含脂肪、蛋白质而定,一般样液呈现绿色后消化30分钟就可以了。
(7)如不及时蒸馏测定,应保存消化原液,到蒸馏时再稀释定容。
消化,消化装置,加速分解的物质,A硫酸钾或硫酸钠二者的作用是提高消化液的沸点,加快有机物分解K2SO4+H2SO42KHSO42KHSO4K2SO4+H2O+SO2,硫酸钾与硫酸的用量比值不宜过大,否则温度太高,生成的硫酸氢铵也会分解,放出氨,而造成损失。
(NH4)2SO4NH3+NH4HSO42NH4HSO42NH3+2SO3+2H2O,B催化剂,a.硫酸铜2CuSO4Cu2SO4+SO2+O2C+2CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H2O+SO2反应中产生的二氧化硫可使氮还原为氨。
硫酸铜的作用,
(1)催化剂;
(2)指示消化终点;(3)蒸馏时作为碱性反应的指示剂。
b.硒粉,2H2SO4+SeH2SeO3+2SO2+H2OH2SeO3SeO2+H2O硒粉用量不宜过多,消化时间不可过长,同时要小心控制消化温度,否则将引起氮素损失。
(NH4)2SO4+H2SeO3(NH402SeO3+H2SO4H2SO43(NH4)2SeO39H2O+2NH3+2N2+3Se,C.氧化汞和汞,HgO+H2SO4HgSO4+H2OHg+2H2SO4HgSO4+2H2O+SO22HgSO4Hg2SO4+SO3+O(有还原物质共存时)Hg2SO4+2H2SO42HgSO4+2H2O+SO2,汞能与氨生成汞氨(基)化合物,在蒸馏过程中不易将氨全部释放出来。
蒸馏时,必须添加少量锌粉使氨游离。
Zn+2NaOHH2+Na2ZnO2(NH2Hg)2SO4+2H2(NH4)2SO4+2Hg也可用硫化钾使汞生成硫化汞沉淀。
氧化汞和汞都是剧毒物质。
C氧化剂,消化时如不容易呈透明溶液,可将凯氏烧瓶放冷后,慢慢加入一定量氧化剂,促使氧化。
a次氯酸钾和高锰酸钾:
氧化性强,可将一部分氨进一步氧化成氮而损失。
b.过氧化氢(30%):
消化速度高,操作简便,使用时须待消化液完全冷却后再加入数滴过氧化氢。
2.蒸馏,
(1)常量法可用直接蒸馏,微量和半微量法采用水蒸气蒸馏。
(2)在这步操作中,一是加入氢氧化钠溶液要过量,二是要防止样液中NH3逸出。
检查蒸馏装置有无漏气现象,防止氨气逸出。
加碱要足量,操作要迅速。
冷凝管口一定要浸入吸收液中,保证吸收完全。
(3)蒸馏时,蒸汽发生要均匀充足,蒸馏过程中不得停火断气,否则将发生倒吸。
利用倒吸的原理可进行仪器的洗涤。
(4)氨是否完全蒸馏出来,可用pH试纸检验馏出液是否为碱性。
3.吸收与滴定,
(1)以硼酸为氨的吸收液:
a.硼酸具有吸收氨的作用;b.用酸滴定不影响指示剂变色反应,可省去标定碱液的操作;c.硼酸的体积要求并不严格,可免去用移液管,操作比较简单。
(2)硼酸吸收液的温度不应超过40。
常量凯氏定氮装置微量凯氏定氮装置改良式凯氏定氮装置,(三)凯氏定氮装置,(四)凯氏自动定氮仪,消化装置为由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热的消化炉。
一次可同时消化8个样品,30分钟可消化完毕。
装置内有自动加碱蒸馏装置,自动吸收和滴定装置及自动数字显示装置,可计算总氮百分含量并记录,12分钟完成1个样。
因样品量少(1g),对含氮量少的样品,此法应用有一定限制。
凯氏自动定氮仪,三、其他方法(快速测定法),
(一)染料结合法,1原理:
利用来源相同的蛋白质碱性(或酸性)氨基酸的含量大致相等的特点,在样品中加入过量的酸性(或碱性)染料,使其和蛋白质形成不溶性盐而沉淀析出,用分光光度计来测定未反应的染料量,然后根据算出来的结合染料量求出蛋白质含量。
2适用范围:
适用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。
3讨论,
(1)适用于多种样品蛋白质的测定,操作比较简单,如样品来源相同,可同时进行多个样品的测定,且灵敏度较高。
(2)必须注意选择染料的问题。
(3)脂肪含量高的样品要用乙醚脱脂然后再测定。
(二)双缩脲法,1原理:
蛋白质中的肽键在碱性溶液中与Cu2+生成紫色络合物,此反应称为双缩脲反应,并且在一定范围内(115毫克蛋白质),生成络合物的深浅与蛋白质含量成正比,可以比色定量(560nm)。
2适用范围:
适用于豆类、油料及米谷类作物种子中蛋白质的测定。
3.特点,
(1)灵敏度较低,所需样品量较大,但操作简单快速。
(2)蛋白质的种类不同,但发色率的变动不大。
(3)当肽中含有脯氨酸时,若有多量糖类共存,则呈色反应不好,测定值偏低。
(4)食品和其他固体物作为试料时,因混有不溶性成分会给比色测定带来困难,在这种情况下,可预先将蛋白质抽出再进行测定。
(三)水杨酸比色法,原理:
样品中的蛋白质经硫酸消化转化为铵盐溶液后,在一定的酸度和温度下与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物(兰色),可以在波长660nm处比色测定,求出样品含氮量,计算出蛋白质含量。
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