实验七质粒DNA的提取和鉴定.ppt
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实验七质粒DNA的提取和鉴定.ppt
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实验七质粒DNA的提取和鉴定,目的,掌握碱裂解法提取质粒的方法了解质粒酶切鉴定原理,质粒DNA能从细菌中提出来,又能再转入细菌,这个过程称转化。
转入的质粒DNA仍能进行复制,产生多个拷贝。
提纯的思路,质粒的特性:
共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质:
蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA,质粒DNA的提取方法,方法:
碱裂解法;煮沸裂解;羟基磷灰石柱层析法,质粒DNA释放法;酸酚法等。
概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:
培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA,根据实验所需),选择哪一种方法主要取决于以下几个因素:
质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求,碱裂解法,基本原理:
1.当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状,离心时可沉淀下来,2.在一定电场强度下,DNA分子的迁移取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样),且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
因此,凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子:
其中超螺旋结构泳动最快,其次为线性结构,最慢的可能是开环结构。
3.溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐),其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间,在紫外线的激发下,发出橙色荧光。
为什么提取的质粒有三条带?
一细菌培养与质粒扩增,挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上(活化菌种),37过夜培养。
从斜面培养基上挑E.coli菌株,接种于25毫升液体培养液内(含氨苄青霉素),37振荡过夜培养。
从中取4毫升种子菌液于LB培养基中(含Ap),37振荡培养3-4小时(OD6001.0)。
二质粒提取,取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中,12000r/min,4,30sec。
吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中,剧烈振荡。
加200L溶液II(新鲜配制),盖紧Eppendorf管,快速颠倒5次,混匀内容物,将Eppendorf管放在冰上。
加入150L溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置5min。
12000r/min,离心5min,将上清夜转至另一Eppendorf管中。
加入等体积酚/氯仿(约450ul),剧烈震荡,12000r/min,离心5min将上清夜转至另一Eppendorf管中,向上清夜加入2倍体积乙醇,混匀后,-20度放置10min。
12000r/min离心5min。
倒去上清夜,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清夜,真空抽干或空气中干燥。
50LTE缓冲液,使DNA完全溶解(-20保存),酶切鉴定,10L溶液+10内切酶缓冲液2L+510U酶到一Eppendorf管,37,1-2h,加2L的反应中止液。
10L,质粒5L,水1L,Bamh11L,Sal13ul,BufferT供20L电泳:
1.1Agrosegel的制备2.上样3.电泳4.紫外灯下观察和拍照,思考题,染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么?
参考答案,纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多,而且染色体DNA被断裂成线状分子,但质粒DNA为共价闭环结构,当加热或用酸、碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象,注意,EB是诱变剂,配制和使用EB染色液时,应带乳胶手套或一次性手套,并且不要将该染色液洒在桌面或地面上,凡是沾污EB的器皿或物品,必须进行清洗或弃去,
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