体外抗菌实验-18.ppt
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,第十九章药物的体外抗菌试验,药物的体外抗菌试验antimicrobialtestinvitro药物的体外抗菌试验是在体外测定微生物对药物敏感程度的试验,已广泛地应用于科研、生产和临床。
如抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、药物含量的测定、药物血浓度测定、指导临床用药的药敏试验等。
抗菌试验包括抑菌试验和杀菌试验。
抑菌:
即抑制微生物的生长繁殖,但不能杀死微生物,在药物除去后微生物又能生长.杀菌:
即能杀死微生物,当药物除去后,微生物也不能再生长繁殖。
第一节常用的体外抑菌试验,连续稀释法色serialdilutiontest可用于测定药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
可以用液体培养基,也可用固体培养基。
1液体培养基连续稀释法(见下图)2固体培养基连续稀释法分平板法和斜面法。
琼脂扩散法agardiffusiontest是利用药物可以在琼脂培养基中扩散,在药物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离,以抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作用强弱。
inhibitionzones,1、滤纸片法适用于新药的初筛试验。
2打孔法适于药物血浓度的监测。
3挖沟法适用于在一个平板上试验一种药物对几种试验菌的抗菌作用。
第二节杀菌试验用以评价药物对微生物的致死活性。
最低杀菌浓度:
指该药物能杀死细菌的最低浓度。
从对微生物广义而言,也可称之为最低致死浓度(MLC)。
是将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释,每管内再加入一定量的试验菌液,培养后可得该药物的MIC,取MIC终点以上未长菌的各管培养液,分别移种于另一无菌平板上,培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC(或MLC)。
活菌计数法是在一定浓度的定量药物内加入定量的试验菌,作用一定时间后,取样进行活菌计数,从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。
石炭酸系数(又称酚系数)是以石炭酸为标准,在规定的试验条件下,作用一定时间,将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较,所得杀菌效力的比值。
棋盘格法是由于在试验时,含两种不同浓度药物的试管排列呈棋盘状而得名,用以评价两种药物同时用不同浓度进行联合试验时的抗菌活性。
第三节联合抗菌试验,在药学上作中,常需检查两种抗菌药物在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不同pH值或不同离子溶液的相互影响。
如加强药物抗菌作用的为协同(synergism);减弱药物作用的为拮抗(antagonism);相互无影响的为无关(indjfference);作用为二者之和的为累加(addition)。
纸条试验即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有一种药液的滤纸条,培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。
梯度平板纸条试验需先制备含药的梯度平板。
将试验菌悬液涂布于平板表面,取滤纸条浸透另一待检药液,按梯度平板中药物浓度递减的方向置于平板表面。
培养后,如该待检药液对平板内的药物有加强作用,则可见沿纸条两边的抑菌区被扩大。
第四节体外抗菌试验的影响因素,1试验菌在抗菌试验中所用试验菌一般应该用标准菌株。
2培养基培养基的质量须加控制。
3抗菌药物药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果,需要精确配制。
第二十章药物制剂的微生物学检查,药物制剂的微生物学检查,药物制剂的微生物学检查主要包括:
规定灭菌药品-无菌检验非规定灭菌药品-微生物限度检查,第一节无菌检查,一、无菌检查的概念及应用范围
(一)概念p333
(二)无菌检查的基本原则采用严格的无菌操作方法,将被检查的药品取一定量分别接种于适合各种微生物生长的不同培养基中(通常为需氧菌培养基、厌氧菌培养基和真菌培养基),置适宜温度下培养一定时间后,观察有无微生物生长,以判断被检药品是否合格。
由于无菌检查是用部分样本的结果推断整体的含菌情况,故被检药品的取样及程序必须按照国家药典的规定进行。
(三)应用范围1各种注射制剂2眼用及外伤用制剂3植入剂4可吸收的止血剂5外科用敷料及器材,第二节无菌制剂的无菌检查,
(一)一般药品的无菌检查一般药品的无菌检查法属于直接接种法,即将检品按规定量直接分别接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中,同时以同样的培养基作阳性对照试验。
我国药典规定以金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、生袍梭状芽胞杆菌CMCC(B)64941、白假丝酵母菌CMCC(F)98001作为需氧菌、厌氧菌和真菌的阳性对照菌株。
然后分别按不同的需要条件培养一定时间,如需氧菌、厌氧菌在3035培养5天,真菌在2025培养7天.观察结果时,阳性对照必须长菌,才能判定供试品是否合格;若阳性对照管不长菌,说明该药物可能有抗菌作用或是油剂等特殊制剂,还应考虑实验条件的合用性.,
(二)特殊药品的无菌检查法如果阳性对照管不长菌,则必须进行特殊处理后方可按照一般药品的无菌检查法进行。
1油类药物的无菌检查一般油剂因与常规培养基不混溶,药品中的微生物不易生长,所以一般可采用吐温(聚山梨酯)培养基,其余同一般药品无菌检查法。
2抗菌药物或含防腐剂药物的无菌检查如果被检药品具有抗菌作用,阳性对照管及试验管均可能不长菌。
因此在进行无菌检查前必须采用一些方法除去药物本身的抗菌作用,然后再依上述方法进行无菌检查。
(1)加入灭活剂:
e.g.在青霉素的无菌检查时,加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液,然后再按一般方法进行无菌检查.
(2)微孔滤膜法(3)稀释法(4)离心沉淀法,第三节-口服药及外用药物的微生物学检查,概念应用范围供试品
(1)供试品的一般要求
(2)供试液,p334,二常用微生物限度检查方法目前对口服药及外用药物的微生物学检验主要是微生物限度检验,即:
(1)染菌量检查:
包括细菌总数、霉菌总数测定。
(2)控制菌检查:
大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等。
我国规定的项目有:
细菌总数测定,霉菌总数测定。
病原菌(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和破伤风梭菌)的检验和活螨的检验等。
判断合格与否的标准是:
口服药及外用药中微生物总量须低于规定限量外,并须在口服药物每克或每毫升中不得含有大肠埃希菌、沙门菌;外用药物每克或每毫升中不得含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风梭菌,此外均不得检出活螨。
细菌总数的测定:
是了解被检药品在单位重量或体积(每克或每毫升)内所含有的活菌数(实际是需氧菌的活菌数),以判断供试药物被细菌污染的程度,是对该药品整个生产过程的卫生学总评价的一个重要依据。
方法:
琼脂倾注平皿法,方法:
取一定量的供试品药物以无菌生理盐水按比例进行系列稀释,加入定量的稀释液于无菌平皿中,再加入一定量的已熔化的、温度在55左右的琼脂培养基混匀,凝固后于37培养2448h,计数平板内菌落数。
一般取菌落数在30300之间的平板进行计数,然后乘以稀释倍数即可得每毫克或每毫升供试药物中的活菌数。
霉菌和酵母菌总数的测定:
是考察供试药物中每克或每毫升所含的活霉菌和酵母菌的总数,以判明检品被真菌污染的程度。
测定方法基本同细菌总数的测定方法。
虎红培养基.252872h(也可在24、48、72h分别计数)选取菌落在550个范围内,乘以稀释倍数即可得单位重量(或体积)中的活真菌总数,病原菌检验的原则:
病原菌的形态和培养特征的观察是鉴别的基本要求,对生化反应、血清学反应、动物毒力试验等项目的要求因菌而异,各有其侧重点。
一般的检测程序为:
药物的准备或预处理增菌培养分离培养纯培养染色镜检、生化试验、血清学试验、动物试验等结果判断。
凡由检品中检出大肠埃希菌时,表明该药品可能被粪便污染,患者服用后,有被粪便中可能存在的其他肠道致病菌和寄生虫卵等病原体感染的危险。
因此,口服药品中不得检出大肠埃希菌。
检验要点:
(1)形态:
革兰阴性短小无芽胞杆菌。
(2)分离培养:
在伊红美兰(EMB)培养基上分解乳糖,产生紫黑色、有金属光泽的菌落。
(3)生化反应:
乳糖发酵试验:
产酸产气或产酸不产气;IMViC试验:
+-,注意与产气杆菌相区别。
1、大肠埃希菌,检验要点:
(1)形态:
革兰阴性短小杆菌。
(2)分离培养:
SS琼脂上,沙门菌不分解乳糖,产生H2S,菌落无色、透明或半透明,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,菌落中心呈黑褐色。
EMB平板上菌落呈无色或粉红色。
三糖铁培养基上分解葡萄糖、产酸产气,不分解乳糖、蔗糖,有动力、产生黑色沉淀。
(3)生化反应:
。
(4)血清学反应:
用可疑菌作为抗原,沙门菌AF组的多价血清作为抗体进行玻片凝集反应,并以生理盐水做对照试验。
2、沙门菌,3、铜绿假单胞菌是条件致病菌,特别在大面积的烧伤、烫伤患者,眼科疾病和其它外伤后,常因感染该菌后病情加重,造成患者伤处化脓,严重的棵引起败血症,眼角膜溃疡甚至失明。
因此,一般眼科制剂和外伤用药中不得检出该菌。
检验要点:
(1)形态:
革兰阴性短杆菌。
(2)分离培养:
在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上菌落扁平,圆形或无定形,湿润,周边扩散或略有蔓延,灰白色,培养基上扩散有水溶性绿色色素。
(3)生化反应:
氧化酶试验阳性,绿脓菌素试验阳性,可报告检出铜绿假单胞菌。
如绿脓菌素阴性,必须明胶液化试验阳性,硝酸盐还原试验阳性,42生长试验阳性,才可报告被检品检出铜绿假单胞菌。
4、金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中致病力最强的一种菌,是人类食物中毒症的常见病原体,也常引起人体局部化脓性感染,严重者可导致脓毒败血症。
目前规定,凡外用药物和眼科制剂不得检出该菌。
检验要点:
(1)形态:
革兰阳性球菌,葡萄状排列。
(2)分离培养及生化试验:
见下表。
如分离培养的可疑菌甘露醇和血浆凝固酶试验均为阳性,则可判断为检出金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌的培养及生化特征菌落特征生化试验,卵黄高盐培养基,甘露醇高盐培养基,甘露醇血浆凝固酶,金黄色,圆形,凸起,边缘整齐,外围有乳浊圈,黑色,圆形,凸起,边缘整齐,外围有黄色环,+,+,5、破伤风梭菌以植物的根、茎为原料的药品,常含破伤风梭菌的污染。
如人体感染此菌后,可引起破伤风,其死亡率达50%。
因此,用于深部组织、创伤和溃疡面的外用制剂不得检出破伤风梭菌检验要点:
(1)形态:
革兰阳性芽胞梭菌,菌体细长,带芽胞的菌体呈鼓槌状。
有周鞭毛,能运动,不形成荚膜。
(2)分离培养:
葡萄糖庖肉培养基中生长,消化肉渣,使肉渣变黑,有特殊臭味。
新霉素葡萄糖血平板上菌落蔓延生长,雾状、细丝状或羽毛状,边缘不整齐,常有溶血环。
(3)毒力试验:
小白鼠皮下注射菌液,648小时观察发病情况。
出现典型的破伤风病症的,判定为阳性。
螨:
是一种小形的节肢动物,可污染药物制剂,使之变质失效,并可直接危害人体健康,传染疾病,引起皮炎、过敏性疾患或消化道、泌尿道和呼吸道疾病。
因此,口服药及外用药中均不得检出活螨。
活螨的检查方法一般有:
直检法、漂浮法和分离法三种,最后都在显微镜下观察有否活动的螨,如有,即可判断检品检出活螨。
第十二章药物的微生物污染与控制,第一节药物微生物污染源一生产环境1厂房2设备3空气二生产原料1中草药2动物性药,三、制药用水四、生产人员,第二节微生物引发的药物变质,一、药物的物理性状改变二、药物的化学成分变化三、药物变质引发的不良后果,第三节防止药物微生物污染的措施,一、无菌技术应用二、环境的无菌化1空气洁净技术要求2空气洁净常用技术三、原辅料的无菌处理1原辅料2制药用水3包装材料的灭菌,四、生产人员的无菌操作1一般生产区2洁净区五、中药原料与中成药的灭菌六、中药原料与中成药的存储与养护
(一)影响存储的因素
(二)养护措施,菌种的选育与保藏,
(一)菌种选育1自然选育:
不经过人工诱变处理,利用菌种的自发突变而进行菌种的选育。
e.g.BCG2诱变育种:
利用各种诱变剂处理以提高基因的随即突变几率。
诱变育种的三个环节:
(1)出发菌株的准备:
纯种、产量稳定、特性稳定、对诱变剂敏感等
(2)突变的诱发:
物理诱变剂:
电离辐射(X射线、射线等)、紫外线等。
化学诱变剂:
烷化剂、嵌合剂、碱基类似物等。
生物诱变剂:
噬菌体(3)突变株的筛选:
筛选方法:
随机筛选理性化筛选(四)突变基因的表达:
研究最佳发酵条件,3杂交育种(selectionbycrossing)选用已知性状的供体菌和受体菌株作为亲本,通过接合或原生质融合使遗传物质重新组合,再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。
(1)准性生殖(parasexualreproduction):
是真菌的一种导致基因重组的过程,有别于有性生殖。
(重组体细胞和一般的营养体细胞没有不同,而且并不产生在特殊的囊器中;染色体交换和染色体减少是不规则的而且不协调的)。
准性生殖过程包括异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单元化。
准性生殖过程中可出现很多新的基因组合。
异核体(heterocaryon):
如使一种类型细胞与另一种类型细胞融合,则可以形成一个同时含有二种以上基因型不同的核,但有一个共同的细胞质的细胞,这种细胞称为异核体。
(2)原生质体融合4基因工程技术改良菌种,
(二)富集培养与菌种筛选利用不同微生物间生命活动的特点,制定特定的环境使适应于该条件的微生物旺盛生长,从而使其在群落中的数量大大增加,便于人们从初筛菌种中分离到所需的特定微生物。
e.g.营养缺陷型(auxotroph)菌株:
营养缺陷型是指某菌株经突变后,丧失了合成某营养素(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的功能,若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长。
原养型营养缺陷型,营养缺陷型菌株的用途:
A.科学实验中的标记菌株B发酵业的生产菌株:
原理是:
该营养缺陷型菌株的分支代谢途径中,某一支合成途径发生酶缺陷,解除了协同反馈调节,可以有效的使另一分支途径中的终产物积累。
(三)纯种分离(四)性能测定1产生菌的性能测定2目的药物的测定,三微生物与基因工程,
(一)基因工程的基本过程(略)
(二)微生物在基因工程中的应用1目的基因的主要供体2目的基因的重要载体3工具酶的来源4克隆载体受体及目的基因表达体系5微生物工程,(三)基因工程在微生物学基础研究及菌种改造中的应用1基因工程在微生物基础中研究2基因工程在传统工业发酵菌种中的应用(四)基因工程与微生物制药1基因工程疫苗
(1)基因重组疫苗:
乙肝、莱嫫病、口蹄疫等疫苗。
(2)重组载体疫苗:
目前使用最多的载体是痘苗病毒,已用于甲、乙型肝炎、麻疹、单纯疱疹等疫苗的研究。
(3)核酸疫苗:
已有HIV、疟疾DNA疫苗在志愿者中试用的报道,但多在研制中。
(4)转基因植物口服疫苗:
优点是易口服、易被儿童接受、价廉等。
已在动物中试验成功。
2重组细胞因子及其可溶性受体(见表11-8,9)
(1)重组干扰素
(2)重组白细胞介素(3)肿瘤坏死因子(4)可溶性细胞因子受体:
sTNFR,sIL-1,sIL-4,etc.3基因工程抗体
(1)噬菌体展示技术:
其基本原理是:
一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术,它以改构的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区,使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面,进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白.,
(2)基因工程抗体的表达系统A.原核细胞表达系统:
细菌B.真核细胞表达系统:
昆虫、酵母、哺乳动物细胞等。
本节重点习题:
1、MIC与MBC的概念2、常用的体外抑菌试验有哪些?
3、体外抗菌试验的影响因素有哪些?
4、口服药及外用药的微生物学检查的项目有哪些?
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