细菌的简单染色和革兰氏染色.ppt
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细菌的简单染色和革兰氏染色.ppt
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实验一细菌的染色,尹会方2012.3.12,球菌,杆菌,弧菌,实验二细菌的简单染色和革兰氏染色,一、实验目的1.学习掌握简单染色的操作技术和无菌操作技术。
2.理解革兰氏染色机理,并掌握其操作技术。
3.了解芽孢染色机理,掌握芽孢染色的方法。
二、实验原理-简单染色,细菌的细胞小而透明,在普通的光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色,使经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便,适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色,这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷,因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷增加,此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
二、实验原理-简单染色,染色前必须固定细菌。
其目的有二:
一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上;二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形。
二、实验原理-革兰氏染色,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
二、实验原理-革兰氏染色,革兰氏染色法的基本步骤是:
先用初染剂结晶紫进行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇(或丙酮)脱色,最后用复染剂(如番红)复染。
经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色),该菌属于革兰氏阴性菌。
二、革兰氏染色机理,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样,所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂,它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物,从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,壁厚、类脂质含量低,用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小,透性降低,从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内,经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时,类脂质被乙醇(或丙酮)溶解,细胞壁透性增大,使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的红色。
三、实验器材,1、菌种:
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌种。
2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。
3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层瓶(香柏油和二甲苯)。
四、实验方法和步骤,细菌的简单染色1、涂片:
用1%盐酸清洁玻片后,在玻片中央滴上一小滴蒸馏水,再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中,并充分混匀涂成薄膜。
2、干燥:
将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。
3、固定:
涂面朝上,通过微火2-3次。
4、染色:
待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上,覆盖涂面染色1-2分钟。
5、水洗:
倾去染色液,用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止(注:
勿冲去菌体)。
6、干燥:
自然干燥,或用吸水纸吸干。
7、镜检:
油镜观察并绘图。
四、实验步骤,1、菌落形态观察:
2、细菌简单染色:
3、细菌革兰氏染色。
注意:
菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、颜色、边缘是否规则等特征。
染色过程:
涂片干燥固定染色(1min)水洗干燥镜检注意事项:
涂片:
取菌量不能太大干燥:
自然干燥水洗:
水流不能直接冲在涂菌处,2.革兰氏染色,1)、涂片:
取清洁玻片一块,在玻片两端1/4处下面用记号笔分别标明S和E(见图示),并滴一滴蒸馏水,分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。
2.革兰氏染色,2、干燥与固定:
方法同
(一)中2,3步骤3、染色:
结晶紫染色1-2分钟-水洗-碘液媒染1-2分钟-水洗-酒精脱色15-20秒-水洗-番红复染色2-3分钟-水洗-干燥-镜检记录。
注意事项:
酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节,如脱色过度,则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌,如脱色不够,则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌,所以脱色时间要很好掌握。
脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响,一般涂片时取菌要少,涂片薄而均匀为好。
被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果,如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率,所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。
染色结果,金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,染色结果,大肠杆菌革兰氏染色结果,染色结果,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果,四、实验结果,绘图记录观察结果,显微镜放大倍数物镜放大倍数目镜放大倍数,附:
油镜的使用,双目显微镜,单目显微镜,2.油镜的原理,油镜的透镜很小,从载玻片透过的光线通过空气时,因介质折光率不同,光线将发生散射现象,使射入镜筒的光线很少,物象不清。
若在油镜与玻璃片之间加入与玻璃折射率相近的香柏油,则使通过的光线不至因折射而减弱,因此能清楚地看到物象。
芽孢染色原理,用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红,在加热条件下染色,使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内,进入菌体的染料经水洗后被脱色,而芽孢一经着色难以被水洗脱,当用对比度大的复染剂染色后,芽孢仍保留初染剂的颜色,而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色,使芽孢和菌体更易于区分。
芽孢染色步骤,
(1)将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌,作涂片、干燥、固定。
(2)滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
(3)用木夹夹住载玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽但勿沸腾,切忌使染液蒸干,必要时可添加少许染液。
加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约45分钟。
(4)倾去染液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
(5)用番红水溶液复染1分钟,水洗至水为无色。
(6)待干燥后,置油镜观察,芽孢呈绿色,菌体呈红色。
注意事项:
(1)选用适当菌龄的菌种,幼龄菌尚未形成芽孢,而老龄菌芽孢囊已经破裂。
(2)加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态,加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂,加热不够则芽孢难以着色。
附:
革兰染色液配方,1草酸铵结晶紫染液A液:
结晶紫(crystalviolet)2g95%酒精20mlB液:
草酸铵(ammoniumoxalate)0.8g蒸馏水80m混合A、B二液,静置48小时后使用。
2卢戈氏(Lugol)碘液碘片10g碘化钾20g蒸馏水300ml先将碘化钾溶解在少量水中,再将碘片溶解在碘化钾溶液中,待碘全溶后,加足水分即成。
3.95%的酒精4.番红复染液沙黄0.25g95%的酒精10ml蒸馏水90ml将沙黄溶于乙醇中,再用蒸馏水稀释。
思考题,1、在制作涂片中,为什么要进行固定这一步?
2、革兰氏染色中哪一步关键,为什么?
3、芽孢染色要注意事项?
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