肿瘤的分子生物学检验.ppt
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肿瘤的分子生物学检验.ppt
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1,肿瘤的分子诊断Moleculardiagnosisoftumor,李江滨副教授,2,第一节肿瘤诊断的生物标志物染色体异常、基因异常、单核苷酸多态性、表观遗传异常、miRNA第二节肿瘤的分子生物学检验技术第三节肿瘤分子生物学检验的临床应用乳腺癌肿瘤分子诊断与个体化医疗,3,什么是肿瘤?
肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。
学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。
4,CancervsTumor,Tumorsaresometimescancerousbutthisdoesnotmeanthattumorsandcancersaresynonyms(asmostpeoplethink).,5,AbnormalcellulargrowthTumorsandcancersaredifferent.Atumordevelopswhenalesionorlump病变或肿块isformedinyourbodyduetoabnormalcellulargrowth.Inthecaseofcancer,thiscellulargrowthisuncontrollableanditspreadsinthebody.,6,TreatmentCancerSurgery,chemotherapyandradiotherapy.TumorRemovingabenigntumorisrelativelyeasythroughsurgery,andtheconditiondoesnotrecur.,7,第一节肿瘤诊断的生物标志物最早的肿瘤标志物:
本-周蛋白,1846年目前已发现一百多种肿瘤标志物蛋白与核酸两大类肿瘤相关染色体异常、基因异常、单核苷酸多态性、表观遗传异常、miRNA,8,一、肿瘤相关的染色体异常多数肿瘤细胞存在染色体异常。
1.染色体数目异常例:
某个癌细胞的染色体共104条,包括许多异常的染色体,9,2.染色体结构异常包括易位、缺失、重复、环状染色体和双着丝粒染色体等。
例:
Ph染色体(费城1号染色体),慢性粒细胞性白血病(CML),9号和22号染色体长臂易位9号原癌基因abl和22号bcr基因组合成融合基因增高的酪氨酸激酶活性。
Ph临床意义在于:
95的CML都是Ph阳性,可以作为诊断的依据。
有时Ph先于临床症状出现,故又可用于早期诊断。
10,二、肿瘤相关基因表达异常原癌基因:
sis、VEGF、EGFR、c-myc抑癌基因:
APC、BRCA、p53、Rb细胞周期调节基因:
cyclins、CDKs、CKIs细胞凋亡相关基因:
Bcl-1、p53、bcr-abl基因组稳定相关基因(DNA修复基因):
APE1肿瘤转移相关基因:
nm23、WDNM、sis、p53肿瘤血管生成相关基因:
VEGF、EGFR、p53,11,三、肿瘤相关单核苷酸多态性Whataresinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)?
SNPs(pronounced“snips”),arethemostcommontypeofgeneticvariationamongpeople.EachSNPrepresentsadifferenceinasingleDNAbuildingblock,calledanucleotide.Forexample,aSNPmayreplacethenucleotidecytosine(C)withthenucleotidethymine(T)inacertainstretchofDNA.,12,13,SNPsoccurnormallythroughoutapersonsDNA.Theyoccuronceinevery300nucleotidesonaverage,whichmeansthereareroughly10millionSNPsinthehumangenome.Theycanactasbiologicalmarkers,helpingscientistslocategenesthatareassociatedwithdisease.WhenSNPsoccurwithinageneorinaregulatoryregionnearagene,theymayplayamoredirectroleindiseasebyaffectingthegenesfunction.,14,MostSNPshavenoeffectonhealth.ResearchershavefoundSNPsthatmayhelppredictanindividualsresponsetocertaindrugs,susceptibilitytoenvironmentalfactorssuchastoxins,andriskofdevelopingparticulardiseases.SNPscanalsobeusedtotracktheinheritanceofdiseasegeneswithinfamilies.FuturestudieswillworktoidentifySNPsassociatedwithcomplexdiseasessuchasheartdisease,diabetes,andcancer.,15,三、肿瘤相关单核苷酸多态性SNP:
Singlenucleotidepolymorphisms1.SNP与肿瘤肿瘤易感基因、肿瘤药物治疗相关基因肿瘤个体化诊疗2.SNP的研究思路研究对象差异性研究技术:
PCR、芯片研究难点:
样本采集,16,四、肿瘤相关表观遗传异常表观遗传:
表观遗传(epigenetics)是指DNA序列不发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变。
这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变,且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。
几乎所有类型的人类肿瘤都存在表观遗传异常抑癌基因的高甲基化和癌基因的去甲基化。
异常甲基化常发生在肿瘤细胞形成的早期。
17,五、肿瘤相关miRNAMicroRNAformationandfunction.flv,18,19,五、肿瘤相关miRNA1.miRNA与肿瘤miRNA与肿瘤发生、发展、诊断、治疗、预后2.miRNA类肿瘤标志物的研究思路研究对象:
实体瘤、细胞、循环血、其他研究技术:
定量PCR、westernblot、芯片、免疫组化、细胞培养(增殖、迁移、浸润)等等,肿瘤相关长链非编码RNA,长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)长度在200-100000nt之间的RNA分子不编码蛋白lncRNA参与细胞内多种过程调控种类、数量、功能都不明确长链非编码RNA在肿瘤发生发展中的位置http:
/,21,第二节肿瘤分子生物学检验技术,肿瘤分子诊断常用的检测标本外周血细胞病灶局部受损组织提取DNA或mRNA检测,22,肿瘤早期诊断标本的选择及处理
(1)样本选择体液、分泌物、排泄物作为早期分子诊断的检测样本,如:
血、痰、大便等。
(2)样本处理:
获取血浆DNA首先获取无血细胞血浆(Cellfreeplasma):
重复离心法:
EDTA抗凝血41500rpm20min吸取上层血浆3000rpm10min。
磁珠法和QIAampDNAminikit在内的多种方法提取循环DNA。
23,循环DNA定量检测方法早期检测方法:
二苯胺法、溴化乙锭法、对流免疫电泳法、RNA-DNA杂交法新的检测技术:
放射免疫法,实时荧光定量PCR法等,24,新型检测标志物:
血浆DNA何谓血浆DNA(plasmaDNA)?
又称循环DNA(circulatingDNA),是一种无细胞状态的细胞外DNA(extracellularDNA),由长度不等的单链或双链DNA及其混合物组成,主要以DNA-蛋白质混合物形式存在,但也存在部分游离DNA。
25,血浆DNA作为检测对象的优势循环DNA来自外周血浆或血清,较组织标本易于获得,可实现无创检查。
DNA比RNA和蛋白质具有更高的稳定性,不宜降解,更适合作为检测的靶分子。
可以对其进行扩增,检测的敏感性高。
越来越多的证据表明,疾病(特别是肿瘤)患者的循环DNA存在量和质的改变。
26,Cell-freeDNAresuscitatedfortumortestingNatureMedicine14,914-915(2008)http:
/,27,肿瘤分子诊断的常用方法,以分子杂交和PCR为核心技术以DNA为主要检测对象1.致病基因结构异常检测2.基因转录水平检测3.基因序列分析及表达检测,28,肿瘤分子诊断的常用方法,染色体数目异常荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH),29,致病基因结构异常检测
(1)斑点杂交(dotblothybridization)
(2)等位基因特异的寡核苷酸探针杂交(allele-specificoligonucleotide,ASO)(3)单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)(4)限制性内切酶图谱(restrictionmap)分析(5)限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)(6)DNA分子杂交(Southernblot),30,致病基因表达异常检测
(1)mRNA检测定量PCR
(2)蛋白检测免疫组化:
定性、半定量、定位Westernblot:
定量,31,第三节肿瘤分子生物学检验的临床应用乳腺癌,32,一、乳腺癌女性发病率高,5%-10%为家族性。
90%家族性乳腺癌涉及BRCA1和BRCA2基因突变。
BRCA1突变可发生在所有细胞,若发生在精子或卵子则可以传给下一代。
其他涉及基因:
p53、PTEN、c-myc、端粒酶等。
论文导读:
Astrongcandidateforthebreastandovarian卵巢cancersusceptibilitygeneBRCA1http:
/www.sciencemag.org/cgi/rapidpdf/266/5182/66.pdf,33,BRCA1BRCA1(breastcancer1,earlyonset早发)isahumantumorsuppressorgene肿瘤抑制基因,whichproducesaprotein,calledbreastcancertype1susceptibility易感性protein.Itisfoundinthecellsofbreastandothertissue,whereithelpsrepairdamagedDNA,anddestroythecellwhenDNAcantberepaired.IfBRCA1itselfisdamaged,thedamagedDNAcanletthecellduplicate复制withoutcontrol,andturnintoacancer.,34,MutationsandcancerriskCertainvariationsoftheBRCA1geneleadtoanincreasedriskforbreastcancer.ResearchershaveidentifiedhundredsofmutationsintheBRCA1gene,manyofwhichareassociatedwithanincreasedriskofcancer.WomenwhohaveanabnormalBRCA1orBRCA2genehaveuptoan60%riskofdevelopingbreastcancer;increasedriskofdevelopingovariancancerisabout55%forwomenwithBRCA1mutationsandabout25%forwomenwithBRCA2mutations.,35,ThesemutationscanbechangesinoneorasmallnumberofDNAbasepairs.ThosemutationscanbeidentifiedwithPCRandDNAsequencing.Othermethodsareproposed:
Q-PCR定量andQuantitativeMultiplexPCR多重定量ofShortsFluorescentsFragments(QMPSF).Newmethodshavebeenrecentlyproposed:
heteroduplexanalysis异源双链分析(HDA)bymulti-capillaryelectrophoresis多毛细管电泳oralsooligonucleotidesarraybasedoncomparativegenomichybridization比较基因组杂交(array-CGH).,36,ResearchersbelievethatthedefectiveBRCA1proteinisunabletohelpfixmutationsthatoccurinothergenes.Thesedefectsaccumulateandmayallowcellstogrowanddivideuncontrollablytoformatumor.,37,女性排名第一的常见恶性肿瘤。
美国每8个人就有1个人一生中会得乳腺癌。
美国患乳腺癌的女性占新发恶性肿瘤的30%,而其中的大约10%的乳腺癌是遗传性的。
乳癌“株连”,一旦家里有人患此疾病,一级亲属(母亲、姐妹或孩子)的女性都应该做检查。
38,乳腺癌高危人群有乳腺癌家族史、基因检测到BRAC1/2基因突变、曾有过胸部放疗史、乳腺活检为高危良性病变、乳腺密度高、初潮年龄早于12岁,以及绝经年龄推迟等的人群,一般患乳腺癌危险性会比较高。
39,40,安吉丽娜朱莉在2013年5月纽约时报上刊文“MyMedicalChoice”,讲述了决定手术的原因及经过,最后呼吁所有女性注意预防乳腺癌。
MydoctorsestimatedthatIhadan87percentriskofbreastcanceranda50percentriskofovariancancer,althoughtheriskisdifferentinthecaseofeachwoman。
Onlyafractionofbreastcancersresultfromaninheritedgenemutation.ThosewithadefectinBRCA1havea65percentriskofgettingit,onaverage。
41,OnceIknewthatthiswasmyreality,IdecidedtobeproactiveandtominimizetheriskasmuchIcould.Imadeadecisiontohaveapreventivedoublemastectomy预防性的双乳切除手术.Istartedwiththebreasts,asmyriskofbreastcancerishigherthanmyriskofovariancancer。
42,2015年3月纽约时报上刊文“diaryofasurgery”Iwantedotherwomenatrisktoknowabouttheoptions.Ipromisedtofollowupwithanyinformationthatcouldbeuseful,includingaboutmynextpreventivesurgery,theremovalofmyovariesandfallopiantubes卵巢和输卵管.Ihadbeenplanningthisforsometime.Itisalesscomplexsurgerythanthemastectomy,butitseffectsaremoresevere.Itputsawomanintoforcedmenopause更年期.,43,ThentwoweeksagoIgotacallfrommydoctorwithblood-testresults.“YourCA-125isnormal,”hesaid.Ibreathedasighofrelief.ThattestmeasurestheamountoftheproteinCA-125intheblood,andisusedtomonitorovariancancer.Ihaveiteveryyearbecauseofmyfamilyhistory.Butthatwasntall.Hewenton.“Thereareanumberofinflammatorymarkersthatareelevated,andtakentogethertheycouldbeasignofearlycancer.”Itookapause.“CA-125hasa50to75percentchanceofmissingovariancanceratearlystages,”hesaid.Hewantedmetoseethesurgeonimmediatelytocheckmyovaries.,44,Thedayoftheresultscame.ThePET/CTscanlookedclear,andthetumortestwasnegative.Iwasfullofhappiness,althoughtheradioactivetracermeantIcouldnthugmychildren.Therewasstillachanceofearlystagecancer,butthatwasminorcomparedwithafull-blowntumor.Tomyrelief,IstillhadtheoptionofremovingmyovariesandfallopiantubesandIchosetodoit.,45,Inmycase,theEasternandWesterndoctorsImetagreedthatsurgerytoremovemytubesandovarieswasthebestoption,becauseontopoftheBRCAgene,threewomeninmyfamilyhavediedfromcancer.MydoctorsindicatedIshouldhavepreventivesurgeryaboutadecadebeforetheearliestonsetofcancerinmyfemalerelatives.Mymothersovariancancerwasdiagnosedwhenshewas49.Im39.,46,Lastweek,Ihadtheprocedure:
alaparoscopicbilateralsalpingo-oophorectomy腹腔镜双侧输卵管卵巢切除术.Therewasasmallbenigntumorononeovary,butnosignsofcancerinanyofthetissues.在一侧卵巢有一个小的良性肿瘤,任何组织都没有癌症迹象。
47,Ihavealittleclearpatch透明贴thatcontainsbio-identicalestrogen雌激素.AprogesteroneIUD黄体酮节育器wasinsertedinmyuterus子宫.Itwillhelpmemaintainahormonalbalance,butmoreimportantitwillhelppreventuterinecancer子宫癌.Ichosetokeepmyuterusbecausecancerinthatlocationisnotpartofmyfamilyhistory.,48,RegardlessofthehormonereplacementsImtaking,Iamnowinmenopause更年期.Iwillnotbeabletohaveanymorechildren,andIexpectsomephysicalchanges.ButIfeelateasewithwhateverwillcome,notbecauseIamstrongbutbecausethisisapartoflife.Itisnothingtobefeared.,49,Ifeeldeeplyforwomenforwhomthismomentcomesveryearlyinlife,beforetheyhavehadtheirchildren.Theirsituationisfarharderthanmine.Iinquiredandfoundoutthatthereareoptionsforwomentoremovetheirfallopiantubesbutkeeptheirovaries,andsoretaintheabilitytobearchildrenandnotgointomenopause.Ihopetheycanbeawareofthat.,50,预防性切乳术能保证今后百分百不患乳癌吗?
国外研究表明,预防性乳房
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- 肿瘤 分子生物学 检验