基因工程复习重点.docx
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基因工程复习重点.docx
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基因工程复习重点
二、简答题
1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
答:
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号.基本原则:
3-4个字母组成,方式是:
属名+种名+株名+序号;首字母:
取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母:
取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母:
(1)取种名的第二个字母,斜体小写;
(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母:
若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体.顺序号:
若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.
2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性?
受哪些因素影向?
答:
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性,但是这种特异性受特定条件的限制,即在一定环境条件下表现出来的特异性。
条件的改变,限制酶的特异性就会松动,识别的序列和切割都有一些改变,改变后的活性通常称第二活性,而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示,因此第二活性又称为星号活性。
概括起来,诱发星活性的因素有如下几种:
(1)高甘油含量(>5%, v/v);
(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U/ugDNA);
(3)低离子强度(<25 mmol/L);
(4)高pH(8.0以上);(5)含有有机溶剂,如DMSO,乙醇等;
(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,C02+,Zn2+等)。
3、影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?
答:
(1)DNA的纯度
(2)DNA甲基化的程度(3)酶切消化反应的温度(4)DNA的分子结构(5)核酸内切限制酶的缓冲液
4、什么是Klenow酶?
有哪些活性?
在基因工程中有什么作用?
答:
Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I,得到两个片段,其中大片段的分子量为75kDa,它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性,小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。
由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性,所以在基因工程中更有用。
Klenow酶主要有下列用途:
(1)修复反应,制备平末端
可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端,制备平末端,这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。
如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸,用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。
用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性,是填补反应;而修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性,是切割反应。
用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的,改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。
(2)标记DNA3'突出末端(protrudingend)
该反应分两步进行:
先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端,产生3'隐含末端,然后在高浓度的标记底物(-32p-dNTP)存在下,使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。
这种反应也叫交换或取代反应(exchange/replacementreaction)。
不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好,因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。
(3)其他的一些用途:
包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primerextension)制备单链DNA探针等。
二、简答题
1、什么是蓝白斑筛选法?
答:
这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。
主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。
外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚——D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。
2、什么是基因文库?
用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系(克隆),在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下,这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。
3、黏性末端连接法是最常用的连接方法,具有许多优点,但是也有一些不足,请指出这些不足之处。
答:
黏性末端连接法不足之处有:
(1)载体易自身环化;
(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆;(3)难插入特定的基因;(4)再者就是大片段DNA的重组率较低,即使用碱性磷酸酶处理了载体,防止了载体的自身环化,载体也有成环的倾向;(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体,增加筛选工作的困难。
4、什么是同聚物加尾连接法?
用何种方法加尾?
具有哪些优缺点?
答:
所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工黏性末端,外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。
这种方法的核心是利用末端转移酶的功能,将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。
以Mg2+作为辅助因子,该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸,如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。
同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法,具有很多优点:
.
(1)首先不易自身环化,这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的,所以不存在自身环化。
(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端,所以连接效率较高。
(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。
同聚物加尾法也有一些不便之处:
(1)方法繁琐;
(2)外源片段难以回收。
由于添加了许多同聚物的尾巴,可能会影响外源基因的表达。
另外要注意的是,同聚物加尾法同平末端连接法一样,重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。
5、何谓接头连接法?
答:
将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列),加到载体或外源DNA的分子上,这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点。
把这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子,这种方法称为接头连接法。
二、简答题
1、常用的工具酶有哪些?
其主要用途是什么?
答:
限制性内切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA连接酶,碱性磷酸酶,末端脱氧核苷酸转移酶.限制性内切核酸酶,能够识别特异的DNA碱基序列,DNA碱基序列往往呈回文对称结构;DNA聚合酶a位于细胞核内,也许是复合物,有催化细胞增生的作用;Klenow大片段它也可以通过基因工程得到,分子量为76kDa。
DNA连接酶负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。
碱性磷酸酯酶的作用是从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基。
末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到DNA分子的3`-OH末端。
2、重组DNA技术常包括哪些基本步骤?
答:
①获得目的基因;②与克隆载体连接,形成新的重组DNA分子;③用重组DNA分子转化受体细胞,并能在受体细胞中复制和遗传;④对转化子筛选和鉴定。
在具体工作中选择哪条技术路线;⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养,获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。
2、何为载体?
一个理想的载体应具备那些特点?
答:
将外源DNA或基因携带入宿主细胞(hostcell)的工具称为载体载体具备的特点:
①在宿主细胞内必须能够自主复制(具备复制原点)②必须具备合适的酶切位点,供外源DNA片段插入,同时不影响其复制③有一定的选择标记,用于筛选④最好具有较高的拷贝数,便于制备。
4、抗性基因是目前使用的最广泛的选择标记,常用的抗生素抗性有哪几种?
并举两例说明其原理?
答:
氨苄青霉素抗性基因ampr、四环素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因Cmr、卡那霉素和新霉素抗性基因kanr①氨苄青霉素抗性基因ampr:
青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成,与有关的酶结合并抑制其活性,抑制转肽反应.氨苄青霉素抗性基因编码一个酶,该酶可分泌进入细菌的周质区,抑制转肽反应并催化b-内酰胺环水解(水解青霉素),从而解除了氨苄青霉素的毒性。
②四环素抗性基因tetr:
四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合,从而抑制核糖体的转位。
四环素抗性基因编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白,可阻止四环素进入细胞。
三、论述题
1、什么是基因组文库(genomiclibrary)?
构建基因组文库,涉及哪些基本过程?
它同遗传学上的基因库有什么不同?
答:
基因组文库是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。
一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体,包括下列过程:
(1)高分子量染色体DNA的制备;
(2)体外重组连接;(3)包装蛋白的制备;(4)重组体的体外包装;(5)将重组DNA导人寄主细胞;(6)筛选。
基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。
基因库(genepool)是指在进行有性生殖的某一群体中,能进行生殖的个体所含总的遗传信息。
在基因组文库的构建中,由于使用的载体不同,分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。
三、论述题1、何谓限制性核酸内切酶?
写出大多数限制性核酸内切酶识DNA序列的结构特点。
答:
限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA双链结构的水解酶.是在DNA分子内部切割,水解磷酸二酯键的核酸内切酶。
能够识别特异的DNA碱基序列,DNA碱基序列往往呈回文对称结构;并具有特异切割位点。
17.如何以细菌(或者大肠杆菌E.coli)质粒DNA为载体克隆一个编码大鼠生长激素的基因,并转化到细菌(或者大肠杆菌E.coli)中进行表达。
分析一下在实验中可能遇到哪些问题及可能的解决办法?
答:
(一)要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达,通常遇到的问题有:
(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。
(解决办法:
在cDNA前加上细菌的启动子。
)
(2)大多数真核基因有内含子,这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA。
细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。
(以激素基因的mRNA为模板反转录成cDNA。
)
(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分工加工而来的,例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来,剩下的两段肽链分别形成胰岛素的a、b链。
(有时可以在离题的条件下进行蛋白质加工过程。
)
(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。
(选用合适的突变型宿主。
)
(二)针对上述可能出现的问题,建议在克隆的过程中采取以下措施:
①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近
②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。
这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。
此外,如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。
合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列,以及1—2个终止密码:
ATG——编码序列——TGATAG。
现在,这个合成基因可被插入载体中。
③有时加工过程可以在离体条件下进行。
如果加工有困难,可以用合成基因,从而免除加工过程。
④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。
如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决,尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。
26、建立了一个文库后,如何鉴定一个携带目的基因的克隆?
答:
带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来,因为基因表达引起了宿主细胞表型的可见变化。
然而,真核生物的基因不都表达,则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。
一个常用方法是噬菌斑杂交(原位杂交)。
(1)从不同的克隆提取DNA,固定于硝酸纤维素滤膜上,然后用NaOH使之变性;
(2)烤干;(3)用带放射性同位素标记的探针与特定基因进行碱基配对(杂交),冲洗滤膜后,未结合上的标记探针会被除去;(4)烘干滤膜后进行放射自显影后,所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来,对照原来的平板,便可以挑选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。
4、转基因是一把双刃剑,请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。
转基因技术所带来的好处是显而易见的,在人类历史进步和发展中起到了积极作用。
首先,通过该项技术可以提供人们所需要的特性,改良培育新品种;
第二,延长食品保存时间或增加营养成分;
第三,将抗虫防菌基因转入到作物中,使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力,减少了农药的使用量,有利于环境保护;
第四,转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。
人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。
外源基因的导入可能会造就某种强势生物,产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性,也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。
转基因作物的大面积种植已有数年,食用转基因食品的人群至少有10亿之多,但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例;更何况目前每一种基因工程食品在上市前,都要经过国家法律认可,食品卫生部门和环境部门的严格检测。
只有测试合格了,才能投放市场。
因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。
三、论述题1、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点?
答:
同:
①原理相同。
琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质,可降低对流运动,故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。
在一定电场强度下,DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。
②凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小;浓度越高,空隙越小,其分辨能力也就越强;反之,浓度降低,空隙就增大,其分辨能力也就随之减弱。
异:
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为02.Kb-50Kb之间;而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范围为1-1000bp,分离小片段效果最好,分辨率极高,相差1bp的DNA也可分开。
33.质粒的类型
1)F质粒:
又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。
它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
F质粒,又称F因子,即致育因子,在寄主细胞中以三中不同的形式存在:
以染色体外环形双链质粒DNA形式存在,其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA片段,这样的细胞称为F+细胞;.以染色体外环形双链质粒DNA形式存在,同时在其上携带有细菌的染色体基因或DNA片段,这样的细胞称为F′细胞:
以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体上,这样的细胞称为Hfr细胞(高频重组细胞)
2).R质粒:
通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因,并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞,使后者也获得同样的抗菌素抗性能力
3).Col质粒:
即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
34.分类:
.结合型质粒(conjugativeplasmid),又叫自我转移质粒,除了具有自主复制所必需的遗传信息之外,还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因
.非结合型质粒(non-conjugativeplasmid),又称非自我转移的质粒,具有自主复制的遗传信息,但失去了控制细胞配对和结合转移的基因,因此,不能从一个细胞自我转移到另一个细胞
70. 碱裂解法原理:
染色体DNA比质粒DNA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子;
当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象;
变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。
1如何有效地提高外源基因的表达效率?
⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提高翻译水平:
①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的⑺减轻细胞的代谢负荷:
①诱导表达②表达载体的诱导复制⑻提高表达蛋白的稳定性,防止其降解:
①克隆一段原核序列,表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质
1、PCR的原理和主要反应过程,并分析影响PCR扩增的影响因素。
PCR原理:
变性温度下,DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA,在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合,然后在DNA聚合酶的作用下,在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链,实现DNA的扩增。
影响PCR扩增的影响因素:
§
(1)Taq酶:
常用1U/25µL
浓度低,扩增产物不够;
浓度高,非特异性扩增增加;
酶的活性;
§
(2)dNTP的浓度:
常用100-200µmol/L,不能低于20µmol/L,特异性、保真性;
§(3)模板:
主要考虑纯度及使用量,对纯度要求不高,但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。
使用量从几个ng到100ng.
§(4)引物浓度:
0.1-0.5µmol/L之间,过多则非特异扩增增加,形成引物二聚体;
§(5)Mg2+浓度:
常用0.5-2.5mmol/L;
影响:
酶的活性、引物-模板退火、特异性
§(6)PCR反应程序设定:
变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数
2、PCR引物设计的原则,若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列,如何设计扩增引物?
(关于如何设计这个问题,靠自己了)
引物设计原则:
1、G+C含量45-55%;
2、Tm值高于55;
3、引物特异性;
4、引物扩增跨度;
5、是否形成引物二聚体
3、Southern杂交一般过程及影响杂交因素。
Southern杂交操作步骤:
(1)用限制性内切酶酶切DNA,经凝胶电泳分离各酶切片段;
(2)转膜:
将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上;
(3)预杂交:
封阻滤膜上非特异性位点;
(4)杂交:
让探针与同源DNA片段特异性结合;
(5)洗脱:
去除非特异性结合的探针;
(6)自显影检查目的DNA所在的位置。
Southern杂交影响因子
1)、目的DNA在总DNA中所占的比例
2)、探针的大小和标记效率
3)、转移到滤膜上的DNA量
4)、探针与靶DNA的同源性
4、基因组文库的构建过程?
如何确定文库的大小?
基因组文库的构建过程:
1)从生物体提取大片断的基因组DNA;
2)用适当的限制性内切酶(常为4碱基识别位点)进行部分酶切或超声波打断基因组DNA;
3)在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的DNA片断(根据载体的要求);
4)载体的酶切、回收;
5)将处理好的基因组DNA片断与载体连接;
6)将重组子导入宿主细胞
7)文库的鉴定、收集、保存;
确定文库大小的方法:
以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性,它与基因文库最低所含克隆数N(即文库大小)之间的关系可用下式表示:
N=ln(1–P)/ln(1–f)
其中:
N:
文库所需的总克隆数;
P:
任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率;
f:
克隆片段的平均大小/生物基因组的大小。
1、什么是星活性,产生星活性的因素可能有哪些?
在非最适合的条件下酶的识别特异性降低,产生非特异性带,这种活性称星活性。
产生Star活性的因素:
(书上P46-P47答案)
高浓度甘油,碱性pH,存在Mn2+,低离子强度,低盐浓度,低pH
2、限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。
(例子和图帮助大家理解而已)
命名规则:
寄主菌属名的第1个字母+种名的前两个字母+菌株或菌型代号(大写)+空白+发现序列(罗马数字)
例子:
EcoRⅠ(E:
属名;co:
种名;R:
株;Ⅰ:
发现次序)
3、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶:
来源不同,识别的序列不同,但能切出相同的粘性末端,连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶:
识别序列相同,切割位点有些相同,有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶
(PS:
完全同裂酶:
识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶:
识别位点相同,但切点不同。
)
4、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些?
1)大肠杆菌DNA聚合酶
2)Klenowfragment
3)T7DNA聚合酶
4)T4DNA聚合酶
5)修饰过的T7DNA聚合酶
6)逆转录酶
7)TaqDNA聚合酶
1、作为基因工程载体,其应具备哪些条件?
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性);
具有合适的筛选标记;
具有较高的外源DNA的载装能力;
具有多克隆位点(MCS);
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
星活性(starctivity)
在非最适的反应条件下,酶的识别特异性降低,产生非特异性带,这种酶切特异性降低的现象,称为星活性。
所谓非最适的反应条件:
过量酶、低盐浓度、过量甘油、高pH(8.0以上)、有机溶剂ex:
酒精(EcoRI对酒精敏感)、SDS、苯酚、氯仿等。
Southern杂交原理和步骤
原理:
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。
步骤:
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
(1)酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。
(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
(4)让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。
探针标记的方法:
1、缺口平移法(NickTranslation)
原理及过程:
反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口,然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性,在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸;同时DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性,在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸,弥补缺口处的核苷酸链。
随着反应的进行底物中被标记单核苷酸,并被随机掺入。
DNA聚合酶I的两种作用交替进行,探针即被标记。
2、随机引物法(6核苷酸引物标记法)
原理及
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