动物细胞培养技术实验指导全面.docx
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动物细胞培养技术实验指导全面
实验篇
实验一实验器材的清洗
实验物品
(一)每一大组公用物品(每班分6大组)
吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
(二)每一小组公用物品(两人一小组)
刻度吸管5毫升4支,小漏斗1个、80-200铜滤网1块、培养皿2个、l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管(1.5毫升,2毫升)2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
(二)公用物品
小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求
(一)使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5%来苏儿或1%盐酸溶液中(依病毒的种类而定)1天以上或高压灭菌。
(二)浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体,不得有气泡。
(三)煮沸前的水面要高于器材5厘米,水沸后投入洗涤剂(直径35厘米的铝锅,用洗衣粉10克左右);若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面,使玻璃碱化PH值上升。
(四)软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去,否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
(五)浸泡器材的蒸馏水容器要专用,并做好标记,如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
(六)器材清洗干燥后,在以后各步操作时,手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作,这样省时又保证清洗质量。
(七)清洁物品应及时包装消毒,应注意妥善保存,防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
(八)刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗;不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法
(一)清洗液(俗称酸液)的配制方法
常用清洁液配方
重铬酸钾100g,浓硫酸200ml,蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下:
先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml,称取1000g重铬酸钾,用玻璃棒搅拌直至溶解(可加热以辅助溶解),待重铬酸钾液冷却后,缓慢加入浓硫酸,边加边用玻璃棒搅动,以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
配好后倒入洗液缸中备用。
新配制的清洁液呈棕红色。
当使用时间过久,清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时,应弃去(深埋地下),配制新的。
配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口,一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。
(二)物品的清洗
1、新购置物品玻璃器皿清洗步骤
清水浸泡半小时以上→简单刷洗→5%的稀盐酸浸泡过夜→自来水冲洗→在洗涤剂中反复刷洗→自来水中充分冲洗→凉干(或50℃烤干)→浸入清洁液中(俗称浸酸)过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3~4次或浸泡2次(每次24小时)→三蒸水冲洗两次(或浸泡一次)→50℃烤干,待包装。
2、用过的玻璃器皿清洗步骤
带毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中,非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡→刷洗→自来水冲洗→凉干(50℃烤干)→浸入清洁液中(俗称浸酸)过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3~4次或浸泡2次(每次24小时)→三蒸水冲洗两次(或浸泡一次)→50℃烤干,待包装。
3、橡皮帽和橡皮塞的清洗
新购置的橡胶制品(大小胶塞、橡皮胶头)的洗涤方法如下;
2%NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→2~5%稀HCl煮沸15分钟→流水冲洗→去离子水煮沸20分钟(或去离子水浸泡过夜)→去离子水冲洗一次→三蒸水煮沸20分钟→三蒸水冲洗一次→50℃烤干备用.
4、塑料制品(塑料培养板、针头式加压塑料小滤器)的清洗
用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签刷洗→流水冲洗→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗20遍→去离子水浸洗三次→双蒸水中浸泡24小时→晾干备用。
注射器薄膜滤器刷洗前先将上、下两部分分开,按上述方法清洗晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间(光面向下)拧紧上下两部分,备用。
5、不锈钢除菌滤器的清洗
先用洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15分钟→去离子水冲洗2~3次(去离子水浸泡24小时)→三蒸水冲洗2~3次或浸泡24小时→干燥备用。
6、镊子、剪刀
纱布擦去脏污→自来水洗净→酒精棉球擦试。
7、金属滤网
自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗。
实验二实验器材的包装和消毒
实验用品
实验一中清洗的所有物品、脱脂棉一卷/班、纱布一卷/班、高压锅一个/班、无菌操作台一台/组、牛皮纸1张/组,纸绳一卷/组、塞脱脂棉用的针头或牙签、记号笔一个/组。
实验方法
(一)包装
1、包装时手指与器材接触面积要小,手指不能触及器材的使用端。
2、瓶类:
需用局部包扎,用牛皮纸包扎。
随后单个或几个一起用纸包好。
3、玻璃管道口(尖吸管、移液管手持端、抽滤瓶下口端等)加脱脂棉,吸管、滴管,随后置玻璃吸管筒或铜制、铝制吸管筒内(内放纱布),塞上棉塞或盖上有孔盖子(内外孔对好),外包上两层牛皮纸,若没有吸管筒应每根吸管单独包扎。
4、带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子,包装消毒后再拧紧。
6、为防止已消毒品和未消毒品发生混淆,应在包装盒或包装纸的表面注以符号或写上字“-”“+”。
(二)器皿的消毒
干热消毒主要用于玻璃器皿的消毒。
160℃、l20分钟,消毒后不要立即打开箱门,以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂,影响消毒效果。
湿热消毒即高压蒸汽消毒:
布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液等都可用此方法消毒灭菌。
消毒时间是从压力达到15磅,温度达到121℃时算起。
一般蒸气消毒30分钟。
橡皮手套和储在小瓶内的溶液都不应超过15分钟。
消毒后,调节活塞使压力在7分钟左右均匀地下降到零。
这样能使任何可能存在的液体得以与周围蒸气以相同的速度散热,而不至于激烈的沸腾。
各种物品有效消毒压力和时间不同,一般要求如下:
培养用液、橡胶制品l0磅l0分钟
布类、玻璃制品、金属器械等15磅20分钟
实验三培养用液的配置
实验用品
实验器材:
1000ml的量筒2个,1000ml的烧杯2个,磁力搅拌器一台,玻璃棒两个,感量0.1mg的分析天平,100ml的盐水瓶若干,
化学试剂:
NaCl,KCl,KH2PO4,Na2HPO4.12H2O2.85g或Na2HPO4.2H2O,NaHCO3,小牛或胎牛血清,胰蛋白酶,醋酸。
实验要求及方法
(一)PBS液
实验室常用含0.85%,pH7.2的PBS(简称pH7.2的PBS)
1.PBS贮存液配法
NaCl(AR)8.5g;KCl(AR)0.2g;KH2PO40.27g;Na2HPO4.12H2O2.85g(或Na2HPO4.2H2O1.13g)溶于100ml双蒸水中。
2.PBS应用液配法
取贮存液50ml加双蒸水450ml即成,经103kPa(121.3℃)15分钟灭菌,置室温或4℃保存备用。
3.配制BSS液的要求
(l)BSS液中各试剂规格为一级GR试剂(guaranteedreagent)或二级AR(analyticreagent)试剂.
(2)配制后液体呈桃红色,pH7.4左右没有混浊和沉淀。
(3)含钙镁离子的物质要单独溶解.
(4)可配制10倍浓度的贮存液,滤过消毒,分装,每瓶10毫升;冰箱保存。
使用时每瓶加三蒸水至l00毫升。
(5)配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用无钙、离子的D—Hanks液,或PBS液。
(二)血清灭活处理的方法:
1.选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。
2.对照瓶内放入与血清等体积的水。
3.温度预试:
使水浴锅温度保待在56℃。
放入内4~5支温度计,选择2~3支温度计,
4.血清灭活:
血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中,待温度计所示温度上升至56℃时定时30分钟。
5.大瓶血清灭活后进行分装。
6.分装后,抽样做无菌试验,-20~-70℃保存。
(三)配制合成培养基(液)注意事项。
1.用三天内制备的玻璃三蒸水配制培养液
2.按二周用量配制为宜,配量过多,存放时间过长会造成培养基老化、变质、产生沉淀。
3.培养液中各成分是否完全溶解的判断方法:
将培养液置室温或4℃冰箱30分钟后,观察瓶底有无颗粒产生。
4.根据实验需要,在培养液中加入适量37℃单独溶解的NaHCO3溶液。
正常体细胞培养液中NaHCO3量为20~22克/升,肿瘤细胞为1.5~1.7克/升。
5.干粉培养基不易溶于水,实验室采用空气CO2助溶法即将甲液在磁场上搅拌一段时间,当甲液pH值下降到5.8左右时(橙黄色)氨基酸和维生素基本溶解,在甲液内再加入溶解有NaHCO3的乙液,两液混和后,营养液pH值为7.0~7.1,抽滤后pH值上升0.1。
此法操作简便,营养液pH值稳定。
(四)胰蛋白酶液
胰蛋自酶是一种黄白色粉末,水解蛋白质时作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架.从而使细胞分离。
胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的,常用的有1:
125和1:
250两种,即1份胰蛋白酶能解离125份或250份酪蛋白。
不同的细胞对胰蛋白酶液的浓度、作用温度和作用时间等要求也不一样。
一般来说,浓度越大、温度越高、作用时间越长,对细胞的分离能力也越大,但超过一定限度就会损伤细胞。
常用的胰蛋白酶液的浓度是0.25%利0.125%,作用温度37℃或室温,pH7.4左右。
Ca2+Mg2+和血清的存在都会降低其活力
O.25%胰蛋白酶液的配制方法如下。
l.过滤消毒法。
①按实验需要称取酶粉,用少量D-Hanks液或PBS液将胰蛋白酶粉调成糊状。
②加适量D-Hanks液或PBS液(橙红色),磁力搅拌溶解
③溶解后的酶液(深红色)滤过除菌,分装,-20℃冻存。
2.高热消毒法。
利用胰蛋白酶在酸性条件下有较好的热稳定性对其进行高热消毒。
①、按实验需要称取酶粉溶于1毫摩尔/升pH3.0的HCl中。
②、酶液和2倍D-Hanks液同时在0.1兆帕,120℃条件下灭菌20分钟。
③、两液冷却至室温时,等量混匀。
酶液浓度高时,消毒后有少量的沉淀,去除沉淀后,两液等体积混匀。
然后用10摩尔/升的NaOH调消化液PH值至7.2(橙红色或深红色)
④、经计算,消毒后酶浓度下降50%。
如消毒前酶浓度为0.1%~0.5%,消毒后为0.05%~O.25%。
高热消毒法比过滤消毒法更加简便、安全、可靠。
(五)PH调整液
1、NaHCO3溶液常用的浓度有7.4%、5.6%、3.7%三种,配制时37℃三蒸水溶解后通过滤膜过滤除菌,分装于安瓶中4℃冰箱保存,每支一次用完。
使用时,NaHCO3液要逐滴加入,并不时搅动培养液。
以防pH值过高。
2、10%醋酸液高压灭菌,分装,4℃冰箱保存。
使用方法和要求同NaHCO3液。
(六)200毫摩尔/升L-谷氨酰胺
L-谷氨酰胺2.9222克(M=146.15),加适量50℃三蒸水溶解.定容至l00毫升,滤过除菌,1毫升/安瓶,一20℃保存使用时每l00毫升培养基中加1毫升谷氨酰胺。
(七)抗菌素液
加适量抗菌素,以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长,而不影响细胞的生长。
通常是青霉素和链霉素联合使用。
青霉素、链霉素液又称双抗溶液。
培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。
(八)细胞用液的分装要求
l.使用严格无菌操作。
尽量减少试剂在空气中的暴露时间。
2.根据配量准备分装瓶和瓶塞,分装瓶规格、数量应根据实验需要准备。
避免因包装瓶过大、贮液时间过长或反复冻融使用造成营养成分丢失和微生物污染。
按一次用量或一周内用量挑选小包装瓶。
融化后的液体置4℃保存。
3.分装前做好分装量标记,分装瓶内液体量要小于瓶容积的2/3。
4.做好分装瓶标记,包括试剂名称、浓度、配制日期、组号。
※采用边过滤边分装的方法。
瓶口的液体用干酒精棉球擦去,火焰消毒,加塞包装。
实验四组织细胞的原代培养
实验操作要领和注意事项
(一)原代细胞培养操作要领
1、原代细胞混匀操作要领
①火焰消毒吸管,用Hanks液冷却和湿润管内壁(这是因为刚分离的组织细胞易粘在管壁上)。
②吸管头插入管底。
③用吸管反复轻轻吹打组织块。
2、器械的使用操作要领
①用工作台消毒镊子取浸泡在酒精中消毒的器械。
②器械置无菌干纱布内擦一下,迅速通过火焰,冷却后使用。
③用过的器械置另一加盖的器皿中再消毒。
④器械按浸泡消毒的顺序使用.
⑤各套再消毒器械不可混用。
3、除去组织块多余水分的操作要领
用吸管将组织块推向器皿一角,然后将有组织块的瓶面翻向上方,吸去流向对侧的多余水分。
注意:
多余水分若不除去,会使组织块剪切不细。
消化后的细胞悬液清亮(细胞数少),并可见消化液中有线状或絮状物漂浮。
4、细胞计数操作要领
①用吸管混匀待计数的细胞悬液。
②将一小滴细胞悬液从盖玻片与载玻片交界部位滴入细胞计数池中。
③沉降1分钟,低倍镜下计数血球计数板四大中格中的结构完整的细胞,小细胞团计数为l。
④计数时,如果细胞压在格上,则数上不数下,数左不数右。
然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数。
(四大中格细胞数/4)×10000=细胞数/毫升
注:
细胞计数板上,每-中格体积为0.1立方毫米。
(二)原代细胞培养注意事项
1、严格进行动物皮肤消毒,使用三套器械取材。
新生动物皮肤先用2%碘酒液消毒,成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒,后再用75%酒精消毒。
2、严格进行无菌操作,防止细菌、霉菌、支原体污染,避免化学物质污染。
3、吸取液体前,瓶口和吸管口应行火焰消毒;吸取液体时,避免两者碰撞。
4、离心管入台前,管口、管壁应消毒。
5、实验者离开超净台时,要随即用肘部关闭工作窗。
6、使用过的器械用酒精棉球擦去血污后,移入另一个器皿中继续消毒,在浸泡器械时剪刀口要叉开放,镊子弯头要向下放,并加盖消毒。
7、器材使用时既要注意用火焰消毒,又要防止烫伤、烫死细胞。
经火焰消毒后的吸管一定要用PBS液冷却。
超净台内温度、湿度较大,在夏天工作时台内散热更慢。
因此进行细胞悬液混匀、接种时,离火焰要稍远些。
实验方法
一、鸡胚成纤维细胞培养
通常应用胚胎或幼小动物的组织来制备细胞培养,因为它们分裂旺盛,容易生长。
各种动物的大多数组织细胞都能在体外培养。
应用最多的为肾、肺、皮肤等,鸡胚组织应用最为普遍。
(一)鸡胚的处理
1.取10~11日龄的鸡胚,在气室部用5%碘酒消毒,用酒精脱碘。
2.用灭菌镊子击破和除去该部卵壳和卵膜。
3.以眼科弯头镊子撕破绒尿膜和羊膜,钩住鸡胚头部,提出移于平皿内。
4.去头、脚、翅和内脏。
用Hanks液或PBS液洗去血液,重复三次。
5.用外科剪剪成1~2mm3大小的碎块。
加Hanks液约20m1混匀,稍静置使组织块下沉。
用灭菌吸管将混有红细胞及碎片的悬液充分吸去。
依同法再洗2—3次,至Hanks液不浑浊为止。
也可将鸡胚投入20m1注射器(不带针头)内挤出,以替代剪碎。
(二)蛋白酶消化
1.将0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.8)于37℃水浴中预热
2.弃去Hanks液。
3.按组织块的3~5倍,将预热好的0.25%胰蛋白酶溶液加于装有鸡胚的玻璃容器中。
每个鸡胚约需胰蛋白酶液l0ml。
4.将玻璃容器放在37℃水浴中,每隔5min轻轻摇匀一次。
5.如发现组织块变得散松,沉降渐变缓慢时即表示消化足够,约需l5~20min.
6.将玻璃容器取出水浴,静置1~2min,吸去胰蛋白酶液,加含犊牛血清的Hanks液约20m1,轻轻摇匀后吸去,如此重复一次,目的是洗去残余的胰蛋白酶和抑制其消化作用。
7.加入生长液,按每个鸡胚10m1左右,以粗口吸管吹吸数次,使细胞脱落分散。
8.静置1~2min,使组织块下沉,细心地轻轻吸出细胞悬液,另置一25m1玻璃容器中。
如此反复数次,将各次收获的细胞悬液合并一起.
9.用灭菌纱布过滤一次,除去偶尔吸入的组织块。
必须注意的是,每次吹吸次数不宜过多,一般5~6次即可,太多细胞容易受损。
(三)细胞计数可借染色法区别活细胞和死细胞,并计算每毫升细胞个数。
1.配制台盼蓝溶液取0.2g台盼蓝,溶于100m1磷酸平衡盐水中贮存,临用前再稀释10倍。
这是一种活体染液,完整的活细胞不被染色,而细胞膜受损后才染成蓝色。
也可用0.01%结晶紫液(用0.lmo1/L柠檬酸配制)染色,这时细胞核被染成蓝紫色,但只能计数而无法区分死活。
)
2.取摇匀的细胞悬液1滴加于玻片上,加染液4滴,混匀后静置4~5min。
3.吸取细胞悬液少许,滴到血细胞计数板上,计算四角4个大格内完整的细胞数,如几个细胞聚集一起,则按一个细胞计算。
然后将活细胞总数换算成每m1中细胞数,最后还要乘以5,因为细胞已被染液稀释5倍。
活细胞数/ml=(4大格活细胞总数/4)×l0000×5
(四)稀释和分装根据细胞计数的结果,以生长液配成每m1含20~40万细胞的悬液,分装细胞培养瓶。
微量细胞培养板每孔(0.3cm2)0.1m1;转瓶培养每100ml容量加10m1细胞悬液。
必须注意,瓶口务必塞紧,不能漏气,否则在培养过程中C02不断逸出而使营养液迅速变碱,而且容易被细菌污染。
(五)生长液和维持液的配方鸡胚细胞较易生长,常用者有下列两种。
1.0.5%乳蛋白水解物95%
犊牛血清5%
青霉素100IU/m1
链霉素100Ug/m1
此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至1—2%即可。
2.Eagle氏MEM95%
犊牛血清5%
青霉素100IU/m1
链霉素100Ug/m1
此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至1~2%即可。
细胞悬液分装后置37℃温箱内静置培养,几小时后细胞即可贴附于瓶壁,24~48h长成单层,此时即可供接种病毒之用。
如发现液体浑浊(有细菌或酵母生长)或有菌丝体(有霉菌生长),应立即弃去。
如为微量细胞培养,可用涤纶胶布将板面密封,置C02培养箱内培养。
如为转瓶培养,可将培养瓶放置在转鼓上,以6~12r/h的速度在37℃培养。
二、兔肾上皮细胞培养
(一)实验材料:
1.兔婴(出生48小时内尚未进食兔婴,体重300~500g)。
2.培养基与试剂:
含10%FBS(或CS)的MEM、CMF-Hanks液、0.25胰酶/CMF-PBS。
3.器具:
各种吸管、离心管、80~100目尼龙网或不锈钢筛网、三角烧瓶、培养皿、瓶,手术刀、剪、镊,1%新洁尔灭消毒缸、解剖板等。
(二)实验方法
1.取肾:
取2日龄内兔婴,将其断颈处死后,放入1%新洁尔灭溶液中浸泡lOmin。
取出兔婴,放置瓷盘内的木板上,背部向上,四脚钉住固定。
用碘酒,酒精消毒背部皮肤,用剪刀和镊子将背部皮肤剪开剥去。
另换剪刀,在腰部背脊长肌两侧剪开腹腔如蚕豆大的缺口,即可看到肾。
用尖头镊子夹紧肾蒂,剪断血管及结缔组织等,将肾提出放在平皿内。
2.组织处理及消化:
剪下肾皮质部分,移入小三角烧瓶内,用小剪细剪成1mm3左右的组织块,用PBS或Hanks液洗3次,吸弃上清液,视其沉下的组织块量,约加10倍量的0.25%胰酶,于37℃水浴中消化30min。
以下步骤及方法与鸡胚细胞制备相同,不赘述。
3.胰蛋白酶消化
分热消化和冷消化两种。
热消化与鸡胚成纤维细胞相同,但时间必须延长到25~30min。
如欲获得更多的细胞,可在消化瓶内预放几十粒玻珠,消化后转动消化瓶使细胞脱落。
在吸出的胰酶~细胞悬液中加入犊牛血清2m1以终止酶的作用。
剩下的组织块另加胰蛋白酶液继续消化20min,重复上述步骤1~2次,即可将组织几乎消化殆尽。
许多实验室喜用冷消化,即在组织块内加入7一10倍量的胰蛋白酶液,在4℃冰箱内消化过夜,翌日晨取出,按热消化法处理。
4、细胞计数同鸡胚成纤维细胞。
5、生长液和维持液的配方
1).0.5%乳蛋白水解物45%
Eagle氏MEM45%
犊牛血清10%
青霉素100IU/m1
链霉素100Ug/m1
此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至3—5%。
2).Eagle氏MEM90%
犊牛血清10%
青霉素100IU/m1
镕霉素100Ug/m1
此为生长液的配方,如为维持液可将血清量减至3~5%。
6、细胞悬液的稀释和分装与鸡胚成纤维细胞同,细胞浓度为50万/m1。
在37℃培养4~5日可以长成单层。
三、鸡胚心肌块的培养
实验用品
1.孵育9~11日龄鸡胚一个
2.培养液:
MEM+20%小牛血清(CS),CS,无钙镁Hanks液(CMF-Hanks)或pH=7.2的PBS。
3.器具:
各种吸管、弯头吸管,60mm培养平皿或25cm2培养瓶,90mm玻璃平皿一个,60mm玻璃平皿3个,镊子、眼科剪、吸管架,鸡卵架等。
实验方法
1.鸡胚摘出:
取9~11日龄鸡胚于卵架上,用碘酒、酒精消毒鸡胚气室侧,用镊子敲开气室部,剪开气室部蛋壳,用镊子摘除卵壳膜,轻轻夹住鸡胚颈部取出鸡胚于无菌90mm平皿内,注意不要强拉鸡胚颈部。
2.制备心肌块:
用镊子固定鸡胚,从腹部向胸部切开,用镊子摘除心脏,移入装有10mlCMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的60ml的平皿内,用刀将心房和血管等切除,心室放CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿中充分洗涤,然后将心室移入另一装有CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS的平皿内,用刀将心室切成适当大小(1~2mm3)小块,于CMF-Hanks液或pH=7.2的PBS液中洗涤数次,转入装有少量生长液的平皿中暂存。
3.培养与观察:
将组织小块转移到培养瓶内,每只体积为25ml的培养瓶内可放置20~30块组织轻轻地倾斜摆动培养瓶,使组织小块均匀地分布于生长细胞瓶内壁表面上。
把瓶盖盖上,放入恒温培养箱内,静置18-24小时,添加少量培养液。
待外植块均巳粘附玻壁上后,约经过2天后,在每只培养瓶内添加足量培养液。
培养至3~5天后,于相差显微镜下观察心肌细胞的形态及节律性收缩现象。
实验五传代细胞的培养
实验材料
1.蛋白酶消化液:
主要是用无Ca2+、Mg2+的平衡盐溶液或者PBS配制的0.08%~0.25%(m/V,下同)胰蛋白酶溶液,其中也可以再补加0.02%的EDTA(或1mmol/L)。
有时候还需要0.02%~0.03%或200IU/ml的胶原酶溶液甚或其它的消化液。
2.培养器皿:
一般与进行原代培养时所用类型相同。
所需数量须根据拟传代的规模而定。
3.培养液及平衡盐溶液:
同原代培养。
实验方法
(一)贴壁细胞传代培养方法
1.取需要传代的细胞培养瓶,轻轻摇动培养瓶数次,悬浮起浮着在细胞表面的碎片,然后连同生长液一起倒出,用无钙镁的磷酸平衡盐溶液洗涤2次。
2.从无细胞面加入0.25%0.1%胰蛋白酶液或0.02%EDTA液(或两者等量混合)4~5ml,将该培养瓶翻转,使消化液浸没细胞层。
3.在37℃放置8~15min。
中途取出,用肉眼或低倍显微镜观察。
如单层边缘略有卷边,或低倍下细胞间已有缝隙,细胞层出现布纹孔,即表明消化适度。
(如果细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形,应立即终止消化。
)
4.将培养瓶倒置,使细胞不再接触酶液,继续在37℃放置几分钟。
5.取出,倾去酶液越彻底越好,加入生长液后用吸管吸吹数次,使细胞分散。
6.装入离心管,离心(1000r/min,5min)。
除去上清含酶溶
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