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体内乌头类生物碱毒物检测方式概述
体内乌头类生物碱毒物检测方式概述
【摘要】概述了利用薄层层析法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、高效液相-质谱联用、多级质谱等方式检测体内乌头类生物碱毒物的方式,旨在为临床诊断和鉴定提供有利的借鉴。
【关键词】乌头;生物碱;毒物检测;高效液相色谱法
乌头类生物碱是一类化学结构复杂和生物活性较强的中药成份,绝大部份存在于乌头属(Aconitum)和翠雀属(Delphinium)植物中。
乌头属植物在我国有170余种,资源十分丰硕,其中有的为常常利用中药材,如川乌、草乌、附子等,可用于镇痛、麻醉、消炎和医治风湿等疾病,功效显著[1]。
乌头类生物碱被以为是这些药材的特征生物活性成份,但大多数乌头属药材都含有大量的有毒双酯型乌头碱[2]。
常见的这种双酯型生物碱的结构见图1,其中乌头碱为此类药材中普遍存在且含量较高的一种。
由于炮制、误服或投毒等原因此引发乌头碱中毒的情况很多,口服乌头碱mg即可引发中毒,致死量为2~5mg[3],医治量与中毒量或致死量接近[4]。
仅1980年以来在国内报导的怀疑是乌头碱中毒的案例达数万宗,并有大量中毒案例未予报导[5]。
这些案例涉及中毒的临床鉴定,鉴定的目的是判定其摄入量是不是超出医治量范围,而这个进程的关键是要准确地检测出体内乌头类生物碱的残留量。
由于乌头碱在体内分解代谢迅速(半衰期t1/2为2min),而且乌头碱中毒亦无特异性临床表现,中毒剂量也因个体不同有很大的不同,临床诊断往往缺少科学依据。
最近几年来由于科技的进步,为体内乌头碱毒物的检测提供了新方式和新技术。
本文概述了检测体内乌头类生物碱毒物的方式,为临床诊断和鉴定提供有利的借鉴。
1传统方式
20世纪80年代以前对乌头类生物碱的检测方式,已报导的有浸渍纸色谱法[6]、气相色谱法[7]、薄层扫描法[8]、微量结晶法[9]、薄层层析法[9]、比色法[9]、紫外分光光度法[9]和红外光谱法[9]等,这些方式或分离不完全,测量误差大,或灵敏度不高,操作繁琐,或样品需要量大,预处置繁琐。
1985年,王月娥等[10]就利用放射性标记法、药代动力学模型和纸层析分析法详细研究过3-乙酰乌头碱在小鼠体内的代谢进程,并取得了几个结果。
①血药浓度:
利用动力学模型算出了该化合物在体内的药代动力学参数。
②组织含量:
在注射5min后胆囊中3-乙酰乌头碱含量最高,以后依次是肝、肾、肺和脾,心脏和脑最低;3h后胆囊中含量明显升高,约为5min时含量的倍;24h后胆囊含量明显降低,而其它组织中含量降低不明显。
给药5d后各组织中仍有必然量,直至7d后脏器中含量才接近衡量。
③排泄浓度:
对小鼠给药30min后尿内已有生物碱排出,12h和24h后尿内生物碱排出量别离为(22±5)%和(27±4)%,3-乙酰乌头碱原型排出量别离为(±)%和(±10)%。
④与血浆蛋白的结合:
结果表明3-乙酰乌头碱与血浆蛋白的结合率为(±)%。
⑤代谢:
3-乙酰乌头碱进入体内后发生代谢分解,以多种形式存在,有3-乙酰乌头碱原型物、乌头碱和其它乌头类生物碱,表明其进入体内后并非当即发生全数3位脱乙酰基转化为乌头碱。
以上结论虽然仅针对3-乙酰乌头碱的代谢,但提供了研究乌头生物碱在体内代谢进程和定性分析毒物种类,和从体内代谢物中分析中毒原因提供了重要思路。
但该方式繁琐费时,灵敏度不高而难于推行。
李绪文等[11]从已灌服乌头碱3h后的家兔胆汁中提掏出代谢物,在薄层色谱(TLC)上快速地展开用碘化铋钾溶液显色,进行了初步快速研究。
实验表明:
①采用的乌头总碱的提取方式和TLC检识条件都可用于乌头碱在动物体内代谢产物的研究,可为因服用乌头碱类药物而致使中毒的法医学快速鉴定提供依据和方式。
②给药3h后,乌头碱在兔体内的代谢产物大量集中在肝脏而不是胆汁中,因此毒物的检测应重点在肝脏。
2高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法是20世纪60年代末迅速发展起来的一种新型分离分析技术,分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高,对药物动力学和临床药学研究的重要性愈来愈突出。
王慕邹等[12]在1983年就较早地利用HPLC测定了10种乌头植物中的乌头碱、中乌碱和次乌碱的含量。
发现虽然乌头类生物碱的最大吸收为230nm左右,但在该波长杂质干扰大,而在240nm检测基线更稳定,可分析各类乌头中的生物碱含量,为检测乌头类生物碱提供了可行的方式。
张兴华等[13]初步探索应用HPLC以甲醇-mol/L碳酸铵水溶液-二氯甲烷(90∶10∶2)为流动相,在ODS反相色谱柱上,以丁卡因为内标,波长为235nm的紫外光,检测了乌头碱注射入家兔静脉后血液中的浓度情况,给出了从血液中定量分析乌头碱的方式。
实验所用乙醚作溶剂来提取血液中乌头碱具有杂质少、毒性小和便于操作等长处;采用丁卡因作内标较诸文献[12]能更好地消除处置进程及色谱查验进程中的误差,提高测定的准确性;采用以无机铵盐作为改性剂的流动相较文献[12,14]中采用有机胺具有毒性低和碱性小的特点,对色谱柱损害小。
在对生物碱高乌甲素的药理活性和毒性已有报导,而其代谢产物不明的情况下,XieFM等[15]针对高乌甲素研究了其在小鼠体内的代谢进程和产物。
作者采用分离效率高的HPLC分离小鼠尿液中的代谢产物,然后用灵敏度高、选择性强的电化学检测器检测各个化合物,再与标准品对照,检测到了此化合物原型和它的4个代谢产物,为针对检测化合物高乌甲素的中毒提供了依据。
武红喜等[16]在实际中毒案例中,应用HPLC选择了理想的流动相和色谱柱,结合薄层层析和紫外光谱分析,成功地检出了乌头碱成份,乌头碱紫外吸收在234nm处有最大吸收。
并将其成功地运用到实际中毒案例中,通过对死者的查验发现乌头碱成份已经达到致死量,肯定了中毒原因。
该方式不足在于灵敏度低,检出限较高。
1996年YoshiokaN等[17]较系统地报导了一例因误食乌头碱而中毒死亡的例子。
他们在其死亡24h后用GasChromatography/SelectedIonMonitoring(GC/SIM)方式分析了病人血清和尿液中的乌头碱含量。
结果在血清中仅发现微量的Jesaconitine,而无乌头碱、中乌碱和次乌碱,这可能与死亡时间太长有关。
相反在尿液中清楚地检测到了乌头碱及其代谢物中乌碱、次乌碱和Jesaconitine,18h后的生物碱浓度远低于13h后的浓度,说明这段时间内生物碱吸收、代谢和排泄相对较快。
GC/SIM方式对体液特别是对血液中生物碱检测的应用,说明该方式对临床上鉴定中毒者是不是因乌头碱中毒的死因具有实用意义和借鉴意义。
同时这种灵敏的方式一样可应用于乌头生物碱的吸收、散布和代谢等基础性研究。
3高效液相-质谱(HPLC-MS)、高效液相-多级质谱联用(HPLC-MSn)
由于GC/MS方式需要繁琐的提取和化合物衍生化进程,OhtaH等[18]第一次选择已经普遍应用于药物领域的HPLC,结合紫外吸收检测、固相提取和快原子轰击质谱方式研究了乌头碱中毒者血液和尿液化学成份。
即用液相色谱/快原子轰击质谱法(HPLC/FAB-MS)从血液中检测到了4种有毒乌头类化合物,即乌头碱、中乌碱、次乌碱和Jesaconitine,洗脱剂采用优化后的四氢呋喃-%三氟乙酸体系(14∶86,V/V),为判断是不是乌头碱中毒提供了依据。
作者考虑到这些生物碱结构中均含有酯键,为了在HPLC/FAB-MS进程当选择适合的溶剂溶解标准品,专门研究了它们在不同溶剂中的稳定性。
发现这些生物碱在碱性溶液中水解最快,在甲醇和乙醇中不稳定,在乙氰、四氢呋喃和稀盐酸中最稳定(表1),因此可以用这些稳定的溶剂溶解样品。
文献[18]中提到血液中生物碱的致死浓度为100-470ng/ml,而应用HPLC/FAB-MS和固相提取相结合方式的检测限能达到50ng/ml,因此即便有其它成份干扰,也能从血液和尿液中检测到毒物的浓度。
以上这些结论对于准确检测生物碱种类和判断中毒原因具有重要意义。
XieFM,ZhangHG等[15,19~21]利用多级质谱可以按照裂解碎片和裂解规律推测化合物的特点,采用固相萃取柱富集、液相色谱/电喷雾离子阱质谱法(HPLC/ESI-MSn)研究了乌头碱在兔体内的代谢产物。
通过提取兔的尿液,对照空白尿液与给药后尿样的二级全扫描总离子流色谱图,发现给药后尿样二级全扫描谱图中有5个新增的色谱峰,通过检测保留时间和裂解碎片,将这5个代谢产物鉴定为乌头碱、16-O-去甲乌头碱、苯甲酰乌头原碱、16-O-去甲基苯甲酰乌头原碱和乌头原碱。
以后,在以上方式基础上引入SIM方式针对4名中毒患者的尿样进行了HPLC/ESI-MSn分析,按照化合物保留时间从中检测到了乌头碱、中乌碱、次乌碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰中乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、16-O-去甲乌头碱和16-O-去甲次乌头原碱。
该方式的灵敏度已达到1ng/ml,因此虽然乌头碱代谢超级快,但通过色谱联用技术仍能检测到其在人体内的存在,对中毒者尿样的检测是有效的。
表1乌头类生物碱在不同溶剂中的半衰期(略)
4小结
本文概述了目前临床上检测体内乌头碱毒物的手腕和方式。
临床实验表明,运用高效液相色谱、多级质谱结合代谢动力学分析体内组织中乌头类生物碱及其代谢产物,在临床上鉴定是不是属乌头生物碱中毒是可行的,具有操作简便、样品需量小、杂质分离效果良好、灵敏度较高和重现性好等特点。
可是对于降解迅速的毒物,查验如不及时或检材保留不妥,毒物的迅速降解可造成检出量的显著不同,因此毒理学鉴定不但应依据检出的绝对毒物浓度,还应依据相对毒物浓度、尸检发现及现场勘查才能作出正确结论。
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