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基因工程课程论文
基因治疗在传染病防治中的应用研究进展
姓名(学号)
(学校邮编)
[摘要]传染病是目前人类所面临的一类重大疾病,在某些疾病状态下,人类还未寻找到理想的治疗方法,如病毒感染等。
现代基因治疗是一种应用基因工程技术和分子遗传学原理,对人类疾病进行治疗的新疗法。
主要是指对致病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因、核酶、基因药物进行疾病治疗的方法。
经过几十多年的发展,技术逐步走向成熟,在传染性疾病的防治中显示了重大的临床应用前景。
传染性疾病的基因治疗包括:
基因疫苗、RNA干扰、胞内抗体、淋巴基因表达等。
[关键词]基因疫苗RNA干扰胞内抗体淋巴基因表达
1.现状
1.1我国传染病现状21世纪人类依然面临着传染病的挑战首先,是新发传染病的挑战。
就全球而言,艾滋病是当前首恶,因其主要通过血液、吸毒、性行为传播,潜伏期长、隐袭性强、控制难度大;特别是妇女感染率高且可以垂直传播,严重危害儿童的身体健康。
由于其病毒极易发生变异,所以到目前为止疫苗仍在试验阶段,缺乏理想的特效药物,免疫损伤治疗难度大,以致非洲个别国家感染人数达其全国人口的一半。
我国2003年比2002年发病率上升44.39%,人类免疫缺陷病毒检出率提高了55%。
2004新年伊始在东北亚韩国、日本及东南亚越南、泰国、柬埔寨以及中国和美国部分地区禽流感暴发,导致大量家禽死亡,同时H5N1病毒在人群感染使20多人丧命,又一次引起全球震惊。
更有严重者,引起疯牛病(在人类称为克雅克病)的朊毒蛋白对煮沸等常用消毒方法不起作用,疾病潜伏期长,病死率高达100%。
这两种传染病不但对人类健康造成了威胁,而且给人的两种主要食物——牛肉、禽肉的供应造成困难。
由于人与动物关系的密切,气候的变化,以及化学物质的广泛应用,微生物发生变异导致新的传染病,甚至恐怖主义制作生物武器,人类势必将面临更多的新的挑战。
其次,老的传染病对人类健康的影响同样不容忽视。
以2002年为例,WHO统计全球发生各类传染病共计356824000例次,占各病种总发病数的23.9%,位居第一,死亡共11122000例,占19.5%,仅次于心血管病⋯。
这说明就全球而言,特别是发展中国家,传染病不可忽视。
据中国疾病预防控制中心报道,我国传染病同年发病2320764例,死亡4520例,病死率0.0195%,均远低于全球平均水平。
但近年除新发传染病外,传统性传染病一些情况值得我们注意:
(1)发病数和发病率:
我国2002年全国传染病报告发病数2440588例次,发病率比2001年下降了5.74%,而2003年发病数2591512例次,发病率比2002年上升5.45%。
(2)死亡例数和病死率:
从死亡人数看,2002年死亡4520例,比前一年死亡3576例增加了26.4%,且2003年比2002年同期又上升了17.43%,增加了1280例。
2003年死亡人数中死于SARS者349例,狂犬病1980例,且后者比2002年增加821例,高于SARS。
(3)病种分布:
2002年和2003年发病数居前3位的均是病毒性肝炎、结核与细菌性痢疾,死亡人数居前3位的是狂犬病、肺结核及病毒性肝炎,其中乙型病毒性肝炎及结核无论发病率及死亡数均居前3位。
乙型肝炎疗效有限,加上慢性化、肝硬化及部分发生肝癌呈链式发展,危害人民健康。
同样,最老的传染病结核主要由于耐药增加近年全球复燃,我国亦面临结核的严重挑战。
2003年其余死亡数位居前10位的其他传染病还有新生儿破伤风、艾滋病、乙型脑炎、SARS、细菌性痢疾、出血热、流行性脑脊髓膜炎。
其中除SARS及艾滋病外,均是老的传染病控制不力出现反复。
儿童传染病死亡原因以破伤风、中毒性菌痢、麻疹与流行性脑膜脊髓炎为主,说明传染病主要危害儿童的特点,影响了国家优生优育的大计[3]。
1.2基因治疗研究现状
1.2.1多种疾病的基因治疗目前,基因治疗的范围已从过去罕见的单基因疾病扩大至常见的单基因疾病和多基因疾病。
遗传性疾病的基因治疗多数属于单基因缺陷所引起的疾病的基因治疗。
Fang等以腺病毒为载体,靶向肝细胞对苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺陷症小鼠模型进行了研究,结果表明小鼠的伤寒表型症状得到明显改善。
而un等则通过反转录状病童T淋巴细胞中苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性的改变状况。
恶性肿瘤的基因治疗已进行了大量的预备性实验,美国科学家构建了重组的TIL(肿瘤浸润淋巴细胞),能表达100倍于正常水平的TNF并应用于黑色素瘤的临床治疗。
另外,用表达IL-2、IFN.2和IL广1的TIL治疗神经母细胞瘤及白等的研究工作也已见报道;还有应用反转录病毒将毒素基因(蓖麻毒素和脊髓灰质炎病毒素中所含的一种蛋白酶的基因)导人癌细胞内,只在靶细胞内表达毒素并发挥杀伤作用,但对其他细胞毒性较低。
对于艾滋病等传染类基因疾病,有研究将HIVLTR3’、5’寡腺苷酸合成酶杂合基因转染HeLa.T4+细胞。
结果表明:
经修饰的带有CD4受体的细胞具有抗HIV感染的作用。
还有将编码可使艾滋病毒HIVRNA降解的核酶基因转染人淋巴细胞,从而抑制HIV的传播。
1.2.2多种药物的基因治疗随着对基因治疗机制本身的不断深人探讨,用于基因治疗的药物形式也不断创新。
基于三链DNA形成脱氧寡核苷酸('rro)的反基因技术能够通过阻止基因转录和DNA复制而达到治疗目的。
Cohen等曾用此技术抑制淋巴瘤的bc1.2基因,而Noonberg等以此对乳腺癌的HER2基因进行了相应的探索。
基因治疗从传统意义上的DNA治疗扩展至RNA水平。
有治疗作用的目的基因的mRNA已用作体内、体外基因治疗的研究。
Nair等IsJ从肿瘤细胞或活组织分离出mRNA,以其对自身提呈抗原的树突细胞进行转染,最终表达出了初始癌抗原(CEA)一T淋巴细胞特异性细胞毒素。
Thierry等采用体外转录的方式,以GFP为报告基因,研究了mRNA在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、鼠黑色素瘤细胞B16.F10、人海拉细胞(子宫颈癌组织细胞株HeLa)、鼠成纤维细胞Ratl等不同细胞系中的表达状况,同时还探讨了不同转染试剂对转染效果的影响,并以蜂毒素肽介导并提高了mRNA的转染效率。
1.2.3多种途径的基因治疗在探讨不同疾病的发病机制、尝试不同基因药物,进行基因治疗的同时,有研究者对基因治疗的新方法新途径进行了大胆的探索。
斯坦福大学研究组采用转座子作为基因载体,在患有血友病的小鼠模型上,将来自鱼的一种编码转座酶的基因与宿主染色体上的凝血因子Ⅸ基因相连接,使小鼠的血液凝结状况大大改善。
基因枪法被证明能够介导外源基因快速进人靶器官。
Takuji等利用基因枪将成骨蛋白.1基因转入椎间盘细胞中并使其获得有效表达。
Weiss等利用基因枪将包裹的细菌疏螺旋体OspC蛋白基因打人Balb/c小鼠体内,介导了Th2反应,并与注射方式进行比较,发现基因枪只介导Th2反应而非Thl反应的原因并非是由于相比注射方式其所输送的DNA数量太少,于CpG的临界浓度所致。
利用消化道大量的黏膜表面以及其中所含有丰富的免疫介导组织,以口服的方式将具有治疗或免疫作用的目的基因1199运送到靶器官已成为基因治疗领域研究的热点。
在以腺病毒为载体对肠上皮细胞进行转导的研究中,During等Luj将带有lacZ基因的腺伴随病毒口服给乳糖不耐症的小鼠模型,在祖干细胞、肠道细胞、固有膜细胞中,外源基因的表达可持续六个月。
MacLaughlin等用壳聚糖作为运送报告基因(编码氯霉素乙酰转移酶基因)的载体,经消化道后在体内得到表达。
另外,Sizemore等发现当减毒的志贺氏菌进人细胞传递质粒后,质粒编码的B半乳糖苷酶引起黏膜免疫。
Ayub等用减毒的沙门氏菌为载体,携带李斯特病菌的单细胞基因毒力因子,对小鼠管饲后发现明显的细胞毒性及辅助T细胞反应,同时也检测到特异性抗体的产生[4]。
2.基因治疗的方法
2.1基因疫苗基因疫苗及DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的第3代疫苗。
其原理是将编码病原体抗原的基因分离纯化,克隆至真核细胞表达质粒载体,经皮下、肌肉注射或口服等方式进入机体,基因在体内表达相对应抗原并刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答,从而使机体获得针对病原微生物、病毒的特异性抵抗能力,达到预防和治疗传染病的目的。
与传统的第1代疫苗一减毒、脱毒病原微生物成分及第2代疫苗一基因工程蛋白多肽相比,基因疫苗具有能把抗原以自然状态形式提供给机体、保护力强、无毒力回复并对不同亚型病原体产生交叉抵抗、易于制备和联合接种、生产成本低、易于保存和运输等优点,已成为具有广泛应用前景的新型生物技术。
它不仅可用来预防和治疗细菌、病毒、寄生虫等传染性疾病,而且在肿瘤、自身免疫性疾病的治疗中具有重要的价值。
DNA疫苗是利用分子生物学技术,根据编码抗原碱基序列,设计并合成特异性引物,用RT—PCR方法从病原微生物RNA分离纯化抗原基因,再通过限制性内切酶方法将DNA克隆至真核细胞表达质粒载体。
通过特定的方法将质粒载体制备成注射制剂或口服制剂。
当这种制剂进入机体后通过载体的作用,DNA可进入机体细胞,在细胞内表达。
病原抗原滞留于细胞内或分泌到细胞外,滞留于细胞内的抗原可特异性活化CD8+Tc细胞,分泌到细胞外的抗原可活化CD4+Th细胞或刺激B细胞产生抗体。
因此,DNA疫苗不仅可诱导体液免疫,还可诱导细胞免疫,比传统疫苗只诱导体液免疫具有显著的优越性[1]。
2.2RNA干扰RNA干扰主要是利用双链RNA在mRNA水平关闭特异序列基因表达或使其沉默的过程,又称转录后基因沉默(post—transcriptionalgenesilencing.PT—GS),能特异性使外源性入侵基因沉默。
RNA干扰最早在植物和线虫细胞中发现,被认为是它们抵抗病毒感染的一种天然免疫防御机制。
目前普遍认为其机制是核糖核酸酶首先将双链RNA切割成21~23个核苷酸的片段,然后酶又与片段结合,由这些片段将酶引导至特异的mRNA上,从而降解mRNA,使特异基因沉默,抑制基因表达[1]。
2.3胞内抗体胞内抗体是一种基因工程抗体。
其方法是采用分子生物学手段,从免疫脾细胞或杂交瘤细胞分离纯化抗体VH和VL基因片段。
再通过特定的连接肽将VH和VL连接起来,构建单链抗体(ScFv)基因,并在基因上加上细胞滞留信号序列,将该基因克隆至真核细胞表达质粒载体,通过特定的方法将质粒载体制备成注射制剂或口服制剂。
当这种制剂进入机体后通过载体的作用,DNA可进入机体细胞,表达单链抗体定向分布于细胞的核、胞浆或特定细胞器中与病毒蛋白结合,干扰病毒蛋白的分泌、加工和活性,从而阻止病毒复制和病毒颗粒组装释放[1]。
2.4淋巴因子转基因表达 淋巴因子在传染病治疗中具有十分重要的作用和广泛的应用前景。
其中的干扰素(IFN)已成为目前抗肝炎病毒治疗唯一公认有效的基因工程药物。
利用淋巴基因表达进行传染病的基因治疗研究,是基因治疗在传染病中的一个重要应用和重要的研究方向[2]。
2.5反义RNA彭国平[5]综述中谈到HBV、HCV是引起慢性肝炎以及肝硬化、肝细胞肝癌等相关疾病的重要病原体,而有效防治此类肝病的关键在于抗病毒,反义核酸技术最早是人工合成或生物合成特定互补的DNA或RNA序列导入靶细胞,形成mRNA—DNA或mRNA—RNA杂交双链,从而抑制或封闭靶基因表达,达到基因控制和治疗的目的[5]。
3.基因治疗在传染病防治中的应用
3.1DNA疫苗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因疫苗在国外已进入I期临床实验,其结果显示:
该疫苗可在体内有效表达HBsAg,并可诱导强烈的免疫反应,产生高效价抗体,同时,志愿者对疫苗具有良好的耐受性。
我国科学家将S抗原基因与IL一2、INF基因连接在同一载体上,构建融合基因给健康小鼠、HBV转基因小鼠使用后,发现CTL活性显著升高,HBsAg特异T细胞增殖能力显著高于对照组,血清抗HBs抗体显著升高。
HIV一1基因疫苗在动物体内可产生有效的免疫应答,减少病毒颗粒释放和对T细胞的损害,在人体内的实验证明它可有效诱导抗HIV抗体产生。
沙眼衣原体MOMP—DNA疫苗给小鼠免疫后可有效诱导抗体产生,其效价高达1:
1250,脾细胞对衣原体的刺激指数显著高于对照组,说明该基因疫苗不仅诱导了体液免疫,同时还诱导了细胞免疫[1]。
3.2RNA干扰(RNAi)近年来随着对RNA干扰研究的深入,一种能在哺乳动物细胞中抑制特异基因表达、只有21个核苷酸的小干扰双链RNA(smallinterferingRNA,siRNA)被发现。
将特异的siRNA通过阳离子脂质体转入Hela细胞和人胚肾293细胞等不同哺乳动物细胞中,获得了可重复的序列特异的RNA干扰,而将长序列的双链RNA转入则出现了非特异抑制。
这些研究成果为RNA干扰的研制提供了前提。
Randall等人发现HCV特异的siRNA可抑制AC和Huh一7肝细胞株中HCV复制,清除细胞内HCV病毒[1]。
3.3胞内抗体在传染性疾病,尤其是病毒感染中的应用越来越受到人们的关注。
抗HIV结构和功能蛋白scFv基因导入HIV感染的淋巴细胞后能干扰HIV病毒转录和复制,而对细胞生长和CD4表达无影响,将其导入表达有CD4和CCR的人骨肉瘤细胞,可抵抗HIV的感染。
抗HIV逆转录酶和抗整合酶的胞内抗体可抑制酶活性,减少病毒复制。
抗CCR5和CD4的胞内抗体可抑制CCR5和CD4的表达并防止HIV感染。
抗HCV外膜蛋白E2的胞内抗体能抑制病毒与靶细胞结合,发挥治疗作用。
抗HCV核心抗原的ScFv能抑制核心蛋白功能和HCV的装配。
我国研究者成军等人报道:
将抗HBV核心抗原SeFv基因克隆至逆转录病毒载体,构建的重组逆转录病毒感染2215细胞后能有效抑制Ⅶ和HBsAg的表达[1]。
3.4干扰素的基因转移与表达 Seif等将小鼠的干扰素β(IFNβ)的基因置于主要组织相容性复合体(MHC)的启动子序列的控制之下,构建重组表达载体,转染Babl/c小鼠的成纤维细胞系NIH3T3,得到了持续的IFNβ的表达。
表达IFNβ的细胞系,对滤泡口炎病毒(VSV),脑心肌炎病毒(EMCV)和塞姆利基森林病毒(Semlikiforestvirus)的复制和表达均有明显的抑制作用。
并发现持续低水平的IFNβ的分泌表达,就可以使这一细胞系产生明显的抗病毒状态。
然而,用等量的外源重组的IFNβ则无此效果。
而且,加入相应的IFNβ的单克隆抗体并不能阻断这种转导的细胞系对上述三种病毒的抑制效应。
因此认为,此细胞系的抗病毒状态的产生,除了和分泌型IFNβ的表达有关以外,还有可能存在其它的作用方式。
另外,Bednarik等将人的α2干扰素(IFNα2)的基因重组到人免疫缺陷病毒(HIV)的长未端重复序列(LTR)中的启动子下游,转入非洲绿肾细胞系中,IFNα2的分泌表达水平持续在50~150u/ml之间。
这一低水平的IFNα2的表达完全可以抑制HIV的复制和转录。
同样地也发现就用相应水平的外源重组的IFNα2也无此效果。
而且IFNα2的单抗也不能阻断IFNα2的抗病毒作用。
这一差别的原因,作者认为体内产生的IFNα2与体外重组的IFNα2的抗病毒机理不同。
外源重组的IFNα2的抗病毒机理,是抑制HIV的成熟和装配过程,而内源表达的IFNα2的抗病毒作用,似乎是主要作用在转录水平以及HIVmRNA的稳定性等方面[2]。
4问题与展望
基因治疗在染性疾病的体内外实验生物治疗中均显示了疗效。
尤其是基因疫苗对机体的保护作用已得到了公认,但其真正进入临床广泛应用尚有一段距离。
还有许多问题须要进一步的验证:
4.1基因疫苗编码抗原的表达问题。
基因疫苗使用时进入机体的是一段DNA片段,其作用的发挥须要DNA在细胞内有效转录和翻译成相应的蛋白,如何能使DNA高效率进入机体细胞并得到高效转录和翻译;
4.2DNA疫苗目前的动物实验显示其免疫效果存在较大的个体差异,总的来看其免疫原性不高
4.3RNA干扰目前虽然是一个研究热点,但其研究工作才起步,其导人体内的方法、稳定性等问题还需要解决;
4.4基因治疗的安全性问题,尤其是选用的载体对机体的影响还须要进一步证实,这一问题在短时间内无法解决。
4.5伦理道德方面的争论也是影响因素之一。
4.6基因转移中的副作用和抗体形成问题。
虽然基因治疗还存在如此诸多问题,但它的理论基础和强大生命力是显而易见的。
经过几年来的发展,基因治疗的研究已逐步从理论走向了临床的实验,人们已获得了不少宝贵的知识与经验,随着分子生物学、免疫学的发展,人类及细菌、病毒等基因组测序的完成,为进一步发展和完善基因治疗奠定了良好的基础,相信不久的将来,基因治疗将在传染性疾病的预防和治疗中发挥重要作用。
参考文献
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(1):
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5.彭国平.反义RNA应用于抗HBV、HCV肝炎病毒的研究进展,国外医学病毒学分册2005,8,12(4):
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