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生理实验扫描
实验l神经肌肉标本制备
两栖类动物的一些基本生命活动和生理功能与温血动物类似,保持其离体组织器官生理活动所需的条件相对来说比较简单,且易于控制.是生理学研究中常用的实验材料,因此,必须掌握两柄类动物神经肌肉标本制备这项基本操作技术。
实验对象和用品
蟾蜍或蛙、两栖类常规手术器械一套(粗剪刀、解剖剪各l把,眼科剪,眼科镊1把、探针1根、玻璃分针2根.锌铜弓1支,玻璃和木质蛙板各1块、线团。
培养皿,烧杯各1个、任氏液(Ringer'ssolution).
实验方法和步骤
I,坐骨神经腓肠肌标本制备(图2-1)
1.左手握蛙躯干及肢体,右手持探针沿枕骨大孔插入.破坏脑和脊髓。
2.在荐尾关节(荐骨与尾骨连接)水平上(前)1cm处用粗剪刀剪断脊柱.将前半躯干,皮肤和内脏一井拉剥弃之.仅保留一段腰背部脊柱及两后肢,並将其放入盛有任氏液的培养皿内.
3,洗净手和所用过的用具,以防沾污标本。
4.用镊子取出标本,放在蛙板上,用解剖剪沿脊柱正中线至耻骨联合中央将标本分为两半,再将左右两大腿放入干净任氏液中备用.
5。
任取一条蛙腿首先腹面向上置于蛙板上,用玻璃分针游离坐骨神经腹腔段,然后换至背侧向上,用大头针固定标本两端,持玻璃分针沿坐骨神经沟(股二头肌及半瞙肌肌间沟)小心分离坐骨神经大腿段,用眼科剪剪去神经干上各细小分支(切忌拉扯)用解剖剪将坐骨神经中枢端连带一小块椎骨剪下.游离坐骨神经至膝关节处。
6.剪去大腿和膝关节周围的肌肉,用剪刀刮净股骨上的肌肉,保留膝关节端股骨长约lcm.剪去其余部分。
7.用棉线结扎小腿背侧的腓肠肌肌腱并在结扎处的后端剪断,游离腓肠肌至膝关节处,将膝关节以下部分全部剪去,至此所保留的即为制备完好的坐骨神经腓肠肌标本。
这时用锌铜弓迅速接触神经,检验标本是否完好.若腓肠肌收缩,表明标本良好,但此时还需将标本放入任氏液中数分钟.以稳定其兴奋性,
8.依次分别用食盐(化学刺激)、热玻棒(热剌激),锌铜弓(电化学刺激),以及小镊子夹捏(机械刺激)坐骨神经的中枢端.观察其反应。
再依次重复用刺激直接刺激腓肠肌,观察其反应,
坐骨神经缝匠肌标本制备
1,将备用的另一条蛙腿置于蛙板上,用大头针在后肢两端作背位固定,找到起自耻骨外侧,止于胫骨上端内侧的缝匠肌.
2,用玻璃分针沿缝匠肌内侧边缘(切勿过深)小心地划开肌外膜,将该肌耻骨端连带一小块骨片切下,用小镊子夹住骨片轻轻提起,仔细地由前向后分离缝匠肌,当分离到后1/3段时,注意寻找支配缝匠肌的坐骨神经分支,它在进入肌内时分成两小支,然后由外周向中枢方向追踪分离坐骨神经至脊髓,连带一小块椎骨剪下.最后将该缝匠肌肌胫骨端结扎、剪断,完全游离坐骨神经缝匠肌标本。
3,将用锌铜弓检测证明完好的标本放人任氏液中5mm左右,待兴奋性稳定以后再取用。
实验2骨骼肌收缩
肌肉兴奋的外在表现是收缩。
根据收缩时长度和张力的变化将其分为等长收缩和等张收缩;无论等长或等张收缩,都可根据所给的刺激频率将其分为单收缩、收缩总和和强直收缩,由一次单刺激引起的收缩叫单收缩;如果两次间隔时间适当的刺激相继作用,即可使两次单收缩融合或总和,从而产生一次更大的收缩;如果给予一连串的刺激,使收缩彼此融合,依据其频率可产生不完全和完全的强直收缩。
实验对象和用品
蟾蜍或蛙、两栖类手术器械一套,培养皿、小烧杯、电刺激器、音叉、生理记录仪、肌槽或张力换能器、墨水、任氏液,
实验方法和步骤
1.生理记录仪记录骨骼肌收缩
1.基本方法步骤同1[若采用的换能器为张力换能器,所记录的收缩以张力变化为主,长度变化次之。
2.将张力换能器(量程Tooe)固定在支架上,标本肌骨固定在肌槽上,跟腱结扎线缚于换能器悬臂梁着力点上,调节肌肉与换能器间的距离,使其处于自然拉长的长度。
换能器输出线接记录仪前置放大器输入插口.
3.接通记录仪电源、调零(直流平衡);选择高频滤波和时间常数,灵敏度约1Omv/cm.拨通记录仪的前级和后级放大器开关,将笔尖调至记录纸中线,刺激器的同步或延迟同步输出与记录仪的外接标记相连。
4.各刺激参数同项目I.记录单收缩时纸速lOOmm/o,再根据纸速计算各时相的持续时间:
记录收缩总和时,纸速20—SOmm/s~记录强直收缩时,纸速5—10mm/s.
讨论题
1.说出单收缩曲线上三个时相的含义,其中潜伏期包括了哪些时间因素?
2.说明复合收缩的基本条件。
3.强直和不完全强直收缩划分的依据是什么?
什么叫临界融合频率?
实验3刺激强度和负荷对骨骼肌收缩的影响
单根的骨骼肌和神经纤维在刺激达到闸值时,它们对刺激的反应是“全或无”式的.而整块肌肉和整条神经干则井非如此,因为肌收缩是以运动单位为基础来实现的,故在阔收缩至最大收缩范围内,反应与刺激强度成正相关,一巨超过此限度,反应亦不再增加.而肌收缩的功效通常是以收缩所作的机械功来表示的,它取决于负荷如何。
在最适负荷下进行收缩,可作最大的功。
因此,在一定范围内为肌肉提供最适前负荷和后负荷,可以增大肌收缩产生的张力,从而提高肌收缩的功效。
实验对象和用品
蟾蜍或蛙、两栖类手术器械一套、肌槽,记纹鼓(或生理记录仪)、电刺激器、可悬挂的小砝码、圆规、直尺、任氏液,记录墨水.
实验方法和步骤
I.刺激强度与肌收缩的关系
1.坐骨神经腓肠肌标本制备同实验1.
2.神经肌肉标本固定在肌槽上(图1),刺激输出接肌槽的刺激电极.肌槽杠杆笔尖与鼓面相切接触,开动记纹鼓画基线,但记录时不开动记纹鼓,只在每次记录后用手转动记纹鼓lcm停下。
凡用波宽o.5fas的单脉冲刺激标本,调节刺激强度,测出肌收缩的闹强度;然后逐次递增刺激强度,得到一系列逐步升高的收缩曲线,直到肌收缩不再随刺激强度的增加而增强,此时的收缩反应叫最大收缩.
.前负荷(或初长度)对肌收缩的影响
1.放松肌槽杠杆下的支托螺丝,于杠杆近支点处的挂钩上加不同重量的砝码(前负荷),以增加收缩前的长度(初长度).在每次刺激前,测量并记录加负荷后的肌肉长度然后施加单个量大刺激(波宽和强度一经选定,不再改动).
实验3血红蛋白含量的测定。
测定血红蛋白最常用最简单的方法是比色法。
血红蛋白的颜色随着与氧结合量的多少而变化,影响比色.但稀盐酸可使血红蛋白转变为稳定的、棕色的高铁血红蛋白.而且颜色与血红蛋白(或高铁血红蛋白)的浓度成正比,与标准色对比,即可得出血红蛋白的含量:
每升血液血液中含血红蛋白克数。
实验对象和用品
血红蛋白计,刺血针。
酒精棉球、蒸馏水、o.1ml/I。
盐酸、95%乙醇,乙醚、1%氨水.
试验方法和步骤
1。
在比色管中加0.1mol盐酸至“10”刻度处。
2.耳垂或指端采血。
拭去第一滴血.待第二滴血自然流出后.用血红蛋白吸管吸血至“20”刻度处,并拭去吸管尖端粘附的血液。
3.将吸管插入比色管内盐酸中.置血液于管底.再吸上层清液2-3次。
洗净吸管中残存血液。
用细玻棒轻轻搅动比色管内的血液.使之与盐酸混匀,
4.置比色管于比色架中,室温放置10min.使血红蛋白转变为高铁血红蛋白。
再滴加蒸馏水于比色管中。
边加边搅拌.直至与标准色相同。
读取比色管内液凹面的最低处刻度比值乘10,即为每升血液中血红蛋白的克数。
注意事項:
1.吸取血液要准确,不得有气泡.
2.轻轻用玻棒搅动,以免损坏比色管.
3.比色时,应将玻棒拿出.
4.立即冲洗比色管.吸管的洗涤按此步骤:
蒸馏水(3次)--95乙醇(1—2次)一乙醚(1-2次).
讨论題
试述影响血红蛋白含量的主要因素.
实验32红细胞和白细胞计数
用特制的血红蛋白吸管或红细胞吸管和白细胞吸管准确吸取一定量的血液,用适当的溶液稀释后,于血细胞计数板计数室内计数—定容积的血液稀释液中血细胞个数,再将所得结果换算为每升血液中的血细胞个数。
实验对象和用品
人,血细胞计数板、红细胞吸管和白细胞吸管<或血红蛋白吸管、]ml和5ml移液管,小试管)、显微镜、刺血针、消毒棉球、干棉球、小吸管、白细胞稀释液(冰醋酸1.:
-’驯B紫1m[、加蒸馏水土100mi)、生理盐水、75H酒精、95阢酒精、乙醚,1%氨水.
实验方法和步骤
1.采血及稀释有两种方法
方法1,用5ml移液管吸取生理盐水3.98ml加入小试管内,加塞备用:
用1ml移液管吸取白细胞稀释液o.38m1,加入另一小试管内,加塞备用,用酒精棉球消毒耳垂或指尖皮肤,待酒精挥发后,用刺血针刺破皮肤,待血液自然流出,擦去第一滴血。
然后用血红蛋白吸管两次分别吸取血液至20ul处,再分别伸入两支小试管的底部,吹出血液,并吸取上清液冲洗吸管内壁的血液.分别振动小试管,使血液和稀释液混匀。
白细胞被稀释20倍,红细胞被稀释200倍.将血红蛋白吸管立即按蒸馏水1—2次一9s%酒精1—2次一乙醚1—2次顺序洗涤。
如果吸管被血凝块堵住,则用1%氨水浸泡.
方法2:
用红细胞吸管吸取血液至球部前端中部“o.5”刻度处,再吸取生理盐水至球部后端“101”刻度处。
用拇指和中指堵住吸管两端.沿水平方向摇动2min,使红细胞与稀释液混匀后,先松开橡皮管端,再放开吸管尖端。
此时红细胞被稀释200倍.用白细胞吸管吸取血液至球部前端中部“o.5”刻度处,再吸取白细胞稀释液至球部后“11”刻度处.同上法振摇,此时白细胞被稀释20倍.红细胞吸管的球部有一红色玻璃珠;白细胞吸管的球部有一白色玻璃珠.用毕后其洗涤同血红蛋白吸管。
2.血细胞计数板的结构:
计数板中央横沟的两边各有一计数室.结构完全相同。
计数室如图,每一计数室用双线和粗单线划分为。
9个大方格。
每个大方格边长lmm。
四角的每个大方格分为16个中方格。
这四个大方格用来计数白细胞。
中央的大方格用来计数红细胞,它又划分为25个中方格,各中方格边线为双线.边长为o.2mm,每—中方格又划分为16个小方格.盖上大盖玻片时,计数室与盖玻片之间的距离为o.1mm,此为计数室的高度.
3.装片.用镜头纸或软绸布擦净计数室和盖玻片。
并于低倍镜下检查。
将盖玻片由计数板正中的一侧推向另一侧,使两者紧密接触。
振荡稀释液后.将红细胞和白细胞吸管球部前端的溶液分别弃去不用,仅用球部溶液装片取红细胞稀释液一小滴帶滴在一侧的盖玻片边缘与计数板之间,溶液呈毛细管现象自动流入一个计数室内,同法将白细胞稀释液装入另一个计数室内。
溶液不可滴入过多,以免盖玻片浮起,造成体积误差,也不能太少而不能充满计数室。
4.计数:
将计数板置于显微镜载物台上静置3-5min,细胞不再浮动后开始计数;计数在低倍镜下进行。
计数红细胞时,数中央大方格中四角的中方格相中央的小方格的红细胞;计数白细胞时,数四角的四个大方格的白细胞。
计数视野的移动路线如图所示,如果细胞压边线.则数上不数下,数左不数右。
如果各中方格内红细胞数相差20个以上·各大格的白细胞相差个以上,则说明细胞分布不匀,需震荡稀释液,重新装片。
实验42离体蟾蜍心脏灌流
用理化特性类似于血浆的生理溶液(如任氏液)灌流离体蟾蜍心脏,可在一定时间内维持其生理特性。
改变灌流液的离子成分或酸碱度,能明显地影响心脏的活动。
支配心脏的神经通过其末梢释放递质,作用于心肌细胞膜上的受体而调节心脏活动,特异受体阻断剂能阻断相应的递质与受体的作用.
实验对象和用品
蟾蜍,蛙类手术器械、蛙心插管,铁支架、试管夹、双凹夹、滑轮、蛙心夹、蛙心杠杆或张力换能器、记纹鼓或生理记录仪、任氏液、o.65HNaC1、3HCaCI:
、1HKC[,39:
乳酸(或o。
5盐酸),2.5%NaHCO3,(或o.5%NaOH).去甲肾上腺素(o.1mg/ml),乙酰胆碱(0。
01mg/ml)、心得安(O.1mg/mi)、阿托品(O.5mR/mi)。
实验方法和步骤
1,心脏插管:
双毁髓,暴露心脏(方法见实验3R)。
在左主动脉干下穿线,打活结。
用眼利剪在左主动脉干上向心剪—斜口,让心脏里的血尽可能流出,并用任氏液将流出的血冲洗干净.将蛀心插管盛一定量任氏液,用食指堵住管口.将插管插入土动脉球.然后稍退出.再将插管沿动脉球后壁向心室中央方向插入,经主动脉瓣进入心室腔内,当插管内的液面随心搏上下波动时,说明插管已进入心室腔内。
扎紧预先打好的活结.井固定到玻璃小勾上。
继续用任氏液在插管内冲洗,直到无血液为止(图6—3).
2.摘出心脏:
结扎右主动脉干,再小心提起插管和心脏,在心脏下方绕一线.结扎左右肺静脉,前后腔静脉,在结扎处的下方剪断,摘出心脏。
3.固定蛙心插管于支架上,用蛙心夹夹住心尖。
通过传动系统,用生理仪记录(图6·4)。
4,在蛙心插管的下1/3处作记号,每次更换任氏液的液面与此标记相平。
5,观察项目:
每个项目前、后都应用室温,新鲜的任氏液进行对照记录,
(1)描记正常心搏曲线,包括观察频率.心室收缩强弱与舒张程度
(2)温度影响:
吸出插管内任氏液,换入4任氏液,在曲出线上作换液标记,观察曲线变化。
当效应明显后,立即换入室温任氏液.曲线恢复正常后,同上法换入4任氏液.观察变化。
效应明显后,换入室温任氏液,
{3)离子的影响:
Na:
,吸出插管内的任氏液,换入o.65XNaC[.观察曲线变化。
效应明显之后,以新鲜任氏液换洗3次.曲线恢复正常之后再进行下—项目的观察,以下各项观察均同此。
C/’:
加入3CaCI2 l-2滴,观察曲线变化,
K’:
加入1XKCl1-2滴.观察曲线变化,·
(4)递质与受体阻断剂的作用:
去甲肾上腺素:
加去甲肾上腺素(o.1mg/mi)1—2滴于新换入的任氏液中,效应明显后换入新鲜任氏蔽。
待心博恢复正常后.加入心得安1一2滴,观察曲线有无变化.再滴加等量的去甲肾上腺素,曲线有无变化,
乙酰胆碱;加乙酰胆碱(Q.01mg/mi)1滴于新换入的任氏液中,待作用明显后.立
既换入新鲜任氏液.待心博恢复正常,然后加入阿托品(0.5mg/ml)l滴,观察曲线有
无变化,再加入等量的乙酰胆碱.观察曲线有无变化。
(5)酸碱的影响:
加3H乳酸(或0。
5HCl)1滴,观察曲线变化.效应明显后,立即用任氏液换洗3次,待心搏恢复正常,
碱:
加25.)、(或c,5XNaOH)1滴.效应明显后,加3%乳酸;或o。
5dHC)l滴,观察曲线变化、
(6)改变插管内液面高度.观察曲线变化。
注意事项
1,心肌插管时。
勿戳穿心壁;摘出心脏时、勿损伤静脉窦,
2,每个观察项目的前,后用新鲜任氏液进行对照记录:
3.插管的液面必须保持相同的高度。
讨论题
1.为什么插管内的液面每次都应保持基本相同的高度?
2以实验为例,说明内环境相对稳定的意义
实验54离体小肠平滑肌的特性
胃肠平滑肌的兴奋性较低,收缩缓慢、仲展性较大,具有紧张性、自动节律性、对化学、温度和牵拉刺激敏感等生理特性,这些特性是与消化道的生理功能相适应的。
利用生理溶液温育离体小肠段,可以观察记录小肠平滑肌的生理特性和理化因素对其生理活动的影响。
实验对象和用品
家兔,麦氏浴槽、烧杯,酒精灯(或平滑肌离体孵育恒温装置)、温度计、氧气袋(或球胆)、通用杠杆和木片描笔(或肌张力换能器)、生理记录仪,铁支架、氧气(或用打气筒给氧气袋充空气)、棉线、缝针、常用手术器械,培养皿、Tvrode's溶液、肾上腺素(o。
1mg/m1)、乙酰胆碱(0。
01mg/ml),阿托品(O.5mR/mi),磷酸组织胺(c.1mg/mi)、毛果芸香碱(1mg/mi)、NaOH(1mol/L)、HCl(1mol/L)、1%BaCI2,1%CaCl2、1MgCI2。
实验方法和步骤
1.实验装置;按图8—1和图8-2安装好孵育及记录装置,孵育液的温度保持在37—38X2,并不断通气.通气速度以连续冒单个气泡,不冲动小肠段为宜.
2.抓住兔的后肢将动物倒悬,猛击后脑,致昏迷后,立即沿腹正中线切开腹部皮肤,沿腹白线剖开腹壁.打开腹腔,取出十二指肠至结肠间的肠段,剪成3-4cm长的小段.放入4f的Tyrode's溶液中轻轻漂洗,以除去肠内容物。
剪去肠壁上的肠系膜和脂肪组织.边洗边通气,换2-3次溶液。
3。
用无创伤缝针将肠的两端穿线,结扎半边肠管。
一端系于通气钩上,另一端系于杠杆或张力换能器上。
肠段完全浸入Tvrode,s溶液中,调节通气量.调节杠杆描记的长短臂之比或记录仪的灵敏度,使描记曲线清晰以便于结果分析。
让肠段稳定20min,便可描记其活动曲线。
4.逐渐降低Tyrode’s溶液温度至30'C,观察描记小肠运动的变化.
5.孵育液温度恢复正常(3738).记录5min正常活动曲线后,依次加入下列各药物,观察记录肠段运动的变化。
每加一种药物,反应明显后,即从侧管放出孵育液,更换2-3次新鲜溶液,肠段恢复正常节律性活动后,记录5min活动曲线.再加入另一种药物。
(1)乙酰胆碱(O.01mg/m1)7—2滴.
(2)肾上腺衰(o.Img/mL)2滴。
(3)毛果芸香碱(1mg/mi)2’3滴。
(4)1%MgCl22—3滴.
(5)lmol/LHCl12滴·,
(6)1“BaCI,1-2滴。
(7)lmol/LNaOH1—2滴.
(8)磷酸组织胺(O.1ing/mi)1—2滴.
(O)1%CaCI:
2—3滴.
注意事项
1·动物先禁食24h,在实验前lh喂食,取出的肠段运动情况较好。
2.为避免麻醉剂对小肠运动的影响,动物不麻醉,猛击后脑而致昏迷或致死.
3.游离及取出肠段时,动作要快,但要避免过度牵拉或使组织干燥而影响其活性,
讨论题
1,根据实验结果,分析各种因素对小肠运动的影响(运动频率、幅度和肠紧张性).并说明其机制.
2.加入乙酰胆碱后再加人阿托品,肠段活动受到抑制,为什么?
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