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精编文档耐高温耐酸硷乙醛脱氢酶的护肝解酒原理
【精编文档】耐高温耐酸硷乙醛脱氢酶的护肝解酒原理
利用耐高温乙醇氧化酶清除人体内的酒精
葛莘
随着生活水平的提高,人们消费酒精类饮料的数量也越来越大。
科学研究及统计分析表明,酒精产品对人们的身体健康、家庭生活和社会活动都有诸多负面影响。
在美国,平均每年有九千万人次急诊病患与饮酒有关,每年有一千人死于饮酒过量。
据2000年10月14日《大连日报》报道,中国的酒精依赖患病率在过去十年中增长了近五倍,由0.12%增加到0.68%,其中因酒精中毒死亡者增长了10倍。
流行病学研究也证实,在精神病院中,近年来因酒精中毒或酒精中毒障碍住院的病人明显上升。
如吉林省延边地区,该比例从1964-1979年平均0%-4%上升至1979-1985年的8.0%-23.5%(沈渔邨,1987,1996)。
酒精对人体的危害
酒精对人体有害,对肝脏最为严重,胃肠道、胰腺、心脏、肾脏等也会造成不同程度的损害。
因此,世界卫生组织(WHO)在一份报告中提出:
“酒精中毒是当今世界世界内第一公害,其毒性可累及全身主要脏器,对肝脏的影响最大。
在西方国家,80%肝硬变(livercirrhosis)的原因是酒精中毒。
酒精中毒对病毒性肝炎、肝癌的发生、发展及预后都有着重要影响。
”
酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化,最终可演变为肝癌。
在欧洲,饮酒量越高的国家,因肝硬化而导致的死亡率越高。
比如,瑞典、丹麦、和英国等国家的人均年饮酒量在10升以下,他们的肝硬化死亡率在万分之十以下;而法国的人均年饮酒量高达27升,他们的肝硬化死亡率是上述国家的三倍。
近年来随着生活水平的提高,酒精性肝病在我国也达到了不容忽视的程度。
据统计,我国11亿中的酒民三亿多人,共中酒精性肝病的发病率在20%左右。
由于肝脏的代偿能力极强,疾病早期一般没有症状或某些单一的症状不足以引起注意,因此,就诊时往往到了比较严重的程度,甚至到了肝脏的失代偿期。
在肝硬化阶段,如果不积极治疗,继续酗酒的话,患者在2-4年内的存活率极低。
酒精的毒害主要来自乙醛
科学家早就证明,乙醛的毒性是乙醇的十倍,所以乙醛是导致酒后症状的主要化学物质(BrienandLoomis,1983)。
乙醛对大脑内胺代谢、ATP酶,细胞线粒体的呼吸功能、脂肪酸氧化功能,以及心肌蛋白质的合成都有很强的抑制作用。
乙醛化学性质活泼,与儿茶酚胺结合能够形成吗啡类似物,是造成酒瘾的主要化学物质;乙醛使羟色胺代谢发生故障,产生有幻觉作用的四氢--咔啉,造成酒后的种种精神障碍(CunninghamandBailey,2001;Eriksson,2001)。
医学界也早就知道过分喝酒可能导致与上消化道有关的癌症。
但是,科学试验证明,酒精本身并不致癌。
那么,饮酒与上消化道癌的关系是怎么建立起来的呢?
越来越多的研究表明,酒精的第一个代谢产物,乙醛,可能是致癌的凶手(Homannetal.,2000)。
一项国际研究工作发现,族群中基因的一个主要区别可能导致唾液具有更高的致癌可能性(Vakevainenetal.,2000)。
这篇研究报告说,酒精一旦进入了身体,肝脏便开始通过代谢反应来清除毒物。
研究显示,大约50%的日本人和华人的酒精代谢酶系统出现故障,使其中间产物乙醛快速、大量积累。
因此,他们喝了酒会更容易出现脸红、晕眩、作呕等征兆。
对这些人来说,他们的唾液中的乙醛含量要比含有健全酶系统的人高出两倍至三倍。
科学家相信,乙醛随着唾液经过喉咙组织时可能导致癌症。
此外,科学家也说,口腔内的细菌也可能具有把酒精分解成乙醛的功能。
因此,不注意口腔卫生的饮酒人士患上癌症的机率更高。
乙醛除了使饮酒者对酒精更加敏感,并造成皮肤温度上升,面赤,心律和呼吸加快,血压降低,口干,喉紧,头痛,恶心等症状之外,还能够造成脑损伤,心肌病(cardiomyopathy),胰腺炎(pancreatitis)和胎儿酒精综合症(fetalalcoholsyndrome)(Eriksson,2001)。
乙醛还能够导致红血球异常(Latvalaetal.,2001)。
乙醛通过血液进入大脑,能够组织神经信号的传递,导致记忆丧失,行为运动失控(Larson,1992)。
对酒精的耐受性受基因控制
酒精在体内的代谢过程主要由肝中的乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)和醛类脱氢酶(aldehydedehydrogenase,ALDH)所制约,它们分别催化的化学反应如下:
C2H5OH(酒精)+NAD+CH3CHO(乙醛)+NADH+H+
CH3CHO(乙醛)+NAD++H2OCH3COOH(乙酸)+NADH+H+
第一个反应生成的乙醛可刺激肾上腺素、去甲肾上腺素等物质的分泌,引起面红耳赤、心率快、皮温高等症状。
除了ADH/ALDH系统之外,微粒体乙醇氧化系统(microsomalethanoloxidizingsystem)也能够将乙醇氧化成乙醛,但在这个酒精代谢中的作用仅占五分之一左右。
人类的乙醇脱氢酶(ADH)系统非常复杂,至少可以分成六类同工酶。
I-V类ADH基因编码,,,,型肽链,通过不同组合,它们可以形成至少八个同型或异型双体。
I类ADH包括同工酶,,亚基,分别由ADH1,ADH2,ADH3基因位点编码,类ADH包括亚基,由ADH4基因位点编码。
这两类ADH都是肝脏酶。
III类ADH包括型肽链,由ADH5基因位点编码,是一个甲醛脱氢酶。
IV类ADH包括型肽链(PID:
g6137442),由ADH7基因位点编码,主要在胃和食道器官表达。
V类ADH由ADH6基因位点编码,但在人体内尚未检查到它的活性。
对VI类ADH的研究不多。
在人类中,I类ADH在乙醇代谢中起主要作用。
成人主要是β链二聚体,来自ADH2基因。
ADH2具有多态性,大多数白种人为ADH2-1,由β1β1组成;而90%黄种人为ADH2-2由β1的变异肽链β2(47位精氨酸→组氨酸)组成(β2β2)(Jornvalletal.,1984;Matsuoetal.,1989)。
β2β2的酶活性约为β1β1的100倍,故大多数白种人在饮洒后产生乙醛较慢,而黄种人积蓄乙醛速度较快(Thomassonetal.,1995;Yinetal.,1992)。
人体内有十多种醛类脱氢酶(ALDH)(Vasiliouetal.,2000;Yoshidaetal.,1998)。
根据对乙醛的Km值高低,可以把人类ALDH同工酶分成两大类:
对乙醛的Km值高的(超过毫摩尔浓度,也就是只有在乙醛浓度高时才有催化作用)和对乙醛的Km值低的(微摩尔浓度,在乙醛浓度低时即有催化作用)。
前者包括ALDH3(Km=83mM)和ALDH4(Km=5mM);后者包括ALDH1(Km=30M)和ALDH2(Km=3M)(Yinetal.,1993)。
所以,人体内的乙醛氧化主要由ALDH1和ALDH2来完成,而ALDH2对乙醛的活性较ALDH1活性高出约10-50倍(Vasiliouetal.,2000;Yoshida,1998)。
ALDH1存在于细胞浆内,ALDH2存在于线粒体内。
ALDH2由54kDa的亚基形成四聚体。
多数东方人种的ALDH2基因为突变型(ALDH2*2,即ALDH2的第487个氨基酸由谷氨酸(E)变成了赖氨酸(K)。
这导致ALDH2*2丧失了脱氢酶的活性(Yoshidaetal.,1984;YoshidaandDave,1985;Farresetal.,1994)。
黄种人中有3种乙醛脱氢酶表现型:
1,普通型,ALDH1+ALDH2*1,约占人口总数的50%;
2,“非经典型atypical”,有ALDH1+ALDH2*2,约占人口总数的50%;
3,罕见的“非经典型”,仅有ALDH2无ALDH1,只在个别日本人中发现。
几乎所有的白种人都为普通型(ShibuyaandYoshida,1988;Thomassonetal.,1994;Yinetal.,1992)。
因此,可以说黄种人较白种人易产生酒精中毒的原因是遗传因素决定的。
由于黄种人的ADH活性高,饮酒后乙醇很快被氧化成乙醛,而由于ALDH的活性低,使乙醛迟迟不能够被氧化成乙酸,所以产生酒后的诸多中毒症状(Yinetal.,1992)。
酒精中毒的基因补救
人体排除酒精的通道有肺脏(呼吸)、肾脏(排尿)和肝脏(代谢),其中90-98%是通过肝脏内的代谢来完成的。
酒精在被饮用之后,要经过口腔、食道、胃和小肠,然后进入血液,其中70-80%以上在肠腔内进入血液,20-30%左右从胃脏进入血液,通过口腔和食道进入血液的仅占极少部分。
血液中的乙醇被运输到肝脏,转化成乙酸,后者最终被分解成二氧化碳和水。
酒精在血液中消失的速度为每小时100-200毫克/公斤体重,一个75公斤体重的健康成人每小时能够代谢7.5-15克乙醇。
除了在肝脏代谢之外,乙醇在从进入口腔到被血液吸收这个过程中被氧化叫做“第一通道代谢("first-pass"metabolism”),主要通过口腔、食道、胃肠内的乙醇氧化酶系统将乙醇氧化。
人类的第四类乙醇脱氢酶-ADH就主要存在于上食道的黏膜,而不存在于肝内(Farresetal.,1994)。
-ADH是所有ADH中活性最高的(MorenoandPares,1991;Morenoetal.,1994;Farresetal.,1994),但由于总量少(大约10微克/克组织),加上乙醇迅速进入血液,所以胃内乙醇氧化在酒精代谢中所起的作用不是很大(Pares,1993)。
很显然,消除酒精毒害的最好办法就是在其进入血液之前,将它氧化成没有毒性的乙酸。
不过,消化系统的环境十分不利于乙醇代谢酶。
首先,胃液的酸硷度(pH值)在1-3左右,平均值大约是2,肠腔(intestinallumen)的pH值可能高达8-9左右。
因此,细胞内的ADH和ALDH在胃中几乎不起作用。
肠胃液体中,除有少量的ADH外,很少有ALDH的存在。
其次,胃液中的离子(特别是胆汁盐)对乙醇氧化酶(ADH和ALDH)也有抑制作用。
再其次,胃肠液中NAD+的含量很少,乙醇的氧化缺乏电子受体,无法进行。
最后,胃液中的蛋白酶更是其他酶的天敌,在它们能够发挥作用之前就已经被分解成氨基酸了。
所以,要通过口服外源乙醇氧化酶来治疗乙醇代谢基因的缺陷,首先要克服上面的问题。
另外还要考虑的问题就是外源蛋白在生产加工过程中的稳定性。
比如人类ALDH2*1在细胞外的稳定很差,经过加工之后,绝大部份生物活性已经丧失殆尽。
乙醇氧化酶系统存在于几乎所有的生物中。
从耐酸、耐硷、耐高温的生物中把相应的基因克隆出来,让它们在生物反应器中超量表达,经过简单纯化,就能够得到大量、纯净的酶制品。
由于它们来自的生物在高温和酸硷环境中生长,所以这些酶一般也能够在相同的环境中起作用。
根据它们的特性,可以把它们制成酸性和硷性饮料或汤料,在饮酒时同时饮用,就能够将酒精代谢产生的乙醛氧化成乙酸,防止其对人体的毒害。
硫叶菌(Sulfolobussolfataricus)是一种从硫矿中分离出来的古细菌,最适生长温度是80oC,最适pH值在2-4之间(Charleboisetal.,1998;Sheetal.,2001)。
硫叶菌的基因组已经全部解码(Sheetal.,2001),其中有13个基因编码乙醇脱氢酶,1个基因编码醛类脱氢酶。
对这些基因进行序列分析,发现其中的ADH3编码的蛋白质具有典型的乙醇脱氢酶结构域,并与人类的第四类乙醇脱氢酶-ADH有45%的相似性;AldhT基因编码的醛类脱氢酶与人类的ALDH2有54%的相似性(见下)。
同样,在嗜硷耐高温枯草杆菌Bacillushalodurans的基因组中,有四个乙醇脱氢酶基因,11个醛类脱氢酶基因,后者中的两个,dhaS和aldA与人类的ALDH2有很高的相似性。
项目内容
利用基因工程手段克隆人类及嗜酸嗜硷耐高温细菌的乙醇、乙醛脱氢酶基因,使其在大肠杆菌和酵母细胞中超量表达,经过纯化之后,与辅剂、添加剂制成片、丸、散、胶囊、汤料等制剂,供消费者在饮酒的同时服用,加速消除体内乙醇、乙醛,达到保肝健体的作用。
技术路线
安全性考虑:
从理论上分析,蛋白质在肠胃消化系统中很快就会被蛋白酶分解成氨基酸,所以,除了少数毒素蛋白质外,绝大多数蛋白质作为食品服用是安全的。
而微生物蛋白供人使用的例子更是多得举不胜举。
比如,金黄葡萄球菌产生的葡激酶可以用来治疗心肌梗塞,病毒蛋白质制成的疫苗可以直接注射到人的体内。
人类食用苏芸金杆菌的B.t.毒素转基因植物,也没有发现有不良后果。
目前已有大量的实验数据证明Bt蛋白只对少数目标昆虫有毒,对人畜绝对安全。
我们选用的蛋白质分别来自人类和两个细菌。
人类蛋白质对人类的安全性自不待言,而这两个细菌都不是动物或人类的病原菌,并且他们都需要在高温和极端酸硷度的环境下才能够生长,所以他们本身并不能够对人体造成危害。
况且,我们只是从细菌基因组编码的上千个蛋白质中选出一个,因此更没有病原菌的问题。
我们克隆的这几个细菌蛋白质,与人的同类蛋白的相似性都接近或超过了50%,并且与毒素蛋白质没有任何相关性。
我们选择的反应器是国际通用的生物反应器,其中啤酒酵母对人类不仅没有任何毒害,而且是营养丰富的食品和食品添加剂。
啤酒酵母是非常好的营养物质,含有大量优质蛋白质,人体消化吸收率可达90%以上;维生素B十个组分达8.5mg/g;维生素D达0.008g/g;无机盐磷、钙、钾、铁、锌、铬、镁等适量。
发达国家早已全部回收作为营养品食用。
例如,日本就利用干燥的啤酒酵母制造减肥食品。
我们使用的大肠杆菌生物反应器是生物工程菌,都不含有大肠杆菌毒素基因。
它的表达效率可高达50%,目标蛋白质经一次纯化即可达到95%以上的纯度。
并且,在纯化目的蛋白的过程中,我们都使用60-80oC高温处理,大肠杆菌蛋白质在该条件下,100%被钝化。
经济效益分析
酒精中毒严重威胁人民的身心健康。
中国有3亿人饮酒,其中一半携带有缺陷型乙醛脱氢酶基因。
即使以十分之一酒民每人每年购买5元的产品计,市场规模即可达到1.5亿元/年以上,再加上作为保健预防用购买的消费者,市场前景极为可观。
而在达到批量生产后,生产成本约为销售价格的5-10%。
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