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宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析
宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析
第42卷第5期
2006年5月
林业科学
SCIENTIASILVAESINICAE
Vo1.42,No.5
May,2006
宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析
郑阳霞季静王罡杨婉身
(1.天津大学农业与生物工程学院天津300072;2.四川农业大学生命科学与理学院雅安625014)
关键词:
宁夏枸杞;八氢番茄红素合成酶基因;克隆
中圈分类号:
$718.46;Q943.2文献标识码:
A文章编号:
1001—7488(2006)05—0138—04
CloningandSequenceAnalysisofPhytoeneSynthasecDNAfromLyciumbarbarum
ZhengYangxia'.JiJingWangGangYangWanshen
(t.CollegeofAgricultureandBiotechnology,Tia~inUniversityTiara'in300072;
2.CdlegeofBiologyandScience,SichuanAgriculturalUniversityn625014)
Abstract:
Anovel1.3kbcDNAwasamplifiedfromeDNAlibraryofLyciumbarbarumbyPCR.ThiseDNAclonewasfurther
insertedintopGEM-T.ThesequeneeanalysisshowedthatthecDNAwasI292bplongwithanopenreadingframeof1275bp,
andencodedapolypeptideof425animoacids.ItscDNAsequenceshowed75%一80%identity.andtheaminoacidsequence
shared70%~80%identitywiththoseofPSYfromLycopersiconesculentum,Capsicumannuum,ArabidopsisthalianaandZea
maysrespectively.indicatingthatthefull-lengthPSYcDNAwasisolatedfromL.barbarum.
Keywords:
Lyciumbarbarum;phytoenesynthase;cloning
类胡萝卜素是植物叶绿体光合作用的辅助色素,并能保护叶绿素免受高温强光的破坏(Bartleyeta1.,
1995).现在越来越多的医学研究表明,类胡萝卜素与人类健康密切相关.约有10%的类胡萝卜素是维生素
A的前体(Krinsky,1989).据统计,每年有70多个国家的3000多万儿童因缺乏维生素A而造成致命性疾病
(Cheryleta1.,1997).此外,类胡萝卜素在防癌抗癌,预防心血管疾病,增强人体免疫力等方面起着重要的作
用(陶俊等,2002).通过对菲律宾,加拿大和中国的食道癌患者的调查已证明J3一胡萝卜素能延缓疾病的进
程(韩雅珊,1999).由于类胡萝卜素在许多植物中含量较低,并且难以用化学方法合成.因此,利用基因工
程手段调控类胡萝卜素的代谢积累,进而大量生产类胡萝卜素已成为研究者们所共识的研究方向之一.目
前通过基因工程手段已获得转类胡萝卜素合成酶基因的"金大米"和"金油菜"(陶俊等,2002).
植物体内类胡萝卜素均通过异戊二烯化合物或萜类化合物合成.代谢主链上有5种酶参与,分别是八
氢番茄红素合成酶(PSY),八氢番茄红素脱饱和酶(PDS),毒一胡萝卜素脱饱和酶(ZDS),番茄红素一环化酶
(LycB)和番茄红素£一环化酶(LycE).随着分子生物学研究手段的发展,编码这些酶的基因已从番茄
(Lycopersiconesculentum),烟草(Nicotianatabacum),辣椒(Capsicumannuum),拟南芥(Arabidopsisthaliana),玉米
(Zeamays)等植物中陆续分离鉴定(陶俊等,2002;Cunninghameta1.,1998).据报道宁夏枸杞(Lycium
barbarum)的总类胡萝卜素含量为2.9527mg?
g(李忠等,1999),其含量之高为植物所罕见.目前有关枸杞
类胡萝卜素合成酶基因的克隆还未见报道.因此选择宁夏枸杞作为试验材料,进行八氢番茄红素合成酶基
因(phytoenesynthase,PSY)的克隆,可为进一步利用基因工程手段生产类胡萝卜素奠定基础.
l材料与方法
1.1材料质粒载体pGEM—Tvectorsystem为Promega公司产品,TaqDNA聚合酶,dNTP和DNAmarker2000
购自大连宝生物工程有限公司,X—gal和IPTG为北京鼎国生物技术有限责任公司产品,其他化学常规试剂为
国产分析纯.大肠杆菌菌株JM109及宁夏枸杞叶片cDNA文库由解放军军需大学植物基因工程研究中心提
供.
1.2PCR模板的制备采用液体培养法提取噬菌体DNA(萨姆布鲁克等,2002).
1.3PCR体外扩增根据番茄,辣椒,拟南芥,玉米等植物PSY基因的保守序列设计一对引物:
引物1(正
收稿13期:
2004—11—22.
*季静为通讯作者.
第5期郑阳霞等:
宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析139
向)GAATTcATGTCTArrI'TGTACGCTATGGGTTGTT;引物2(反向)GCGGCCGCTCATGTTTGGGGTAT
CATAAAAGA.在25"L反应体系中,加入10×PCRBuffer(Mg215mmol?
L)3.0L,dNTP(各2.5mmo|'
LI1)2.5"L,引物1(20tool?
LI1)和引物2(20m0l?
L)各1.5L,TaqDNA聚合酶(5U'LI1)O,5,模板
DNA2.5n譬.反应条件:
94℃3min一(94℃1min一55℃1Illin一72℃2rain)如--~72℃10min.扩增反应在
德国UNOIIBiometraDNA扩增仪上进行.反应结束后在1%琼脂糖凝胶上电泳检查.
1.4扩增产物的克隆与DNA序列测定采用北京鼎国生物技术发展中心的DNA片段回收试剂盒回收PCR
扩增产物.回收产物与pGEMT载体进行连接,连接产物转化大肠杆菌JM109.在含氨苄青霉素的培养基上
进行蓝白斑筛选.随机挑取白色菌落,用碱裂解法小量提取质粒DNA,并进行PCR和双酶切(SacI,Nco工)
鉴定.由华大基因上海鼎安生物科技有限公司用DNA荧光自动序列分析仪进行序列测定.
2结果与分析
2.1PSY基因的体外扩增与克隆用PCR技术从cDNA
文库中扩增出一条特异性片段,大小约1.3kb,与预期大小
相符(图1).经过多次重复,均得到相同的结果,初步证明
PCR扩增成功.将该片段纯化后,克隆至pGEM—T载体,转
化JM109.通过PCR和双酶切鉴定,筛选出插入片段在
1.3kb的重组质粒(图1).成功构建的重组质粒命名为
pGEM—PSY.
2.2PSY基因的序列分析重组质粒pGEM一l,的DNA
序列分析结果表明,分离克隆的PSY基因cDNA全长1292
bp,阅读框位于7~1284bp之间,共编码425个氨基酸(图
2).与其他植物PSY基因核苷酸序列同源性比较发现,与
番茄(A21360)(Rayeta1.,1987),辣椒(X68017)(Romeret
nf.,1993),拟南芥(L25812)(Scolniketa1.,1994),玉米
(U32636)(Bucknereta1.,1996),黄水仙(Narcissus
2kb
1kb
图1凝胶电脉图谱
Fig.1Geleleetrophoresismap
1.4.6DNAMarker2000;2PCR产物PCRproduct;3质粒pGEM.
PSY的PCR扩增鉴定IdentificationofpGEM.PSYbyPCR~5质粒
pGEM-PSY的酶切鉴定IdentificationofpGEM-PSYbyrestriction
enzymesdigestion.
pseudonarcissus)(X78814)(Schledzeta1.,1996),甜瓜(Cucumismelo)(Z37543)(Karvounieta1.,1995)的同源性分
别为78%,80%,77%,75%,79%,80%.另外,该基因所编码的氨基酸序列与其他植物的同源性高达70%~
80%,肽链长度相仿,由410~425个氨基酸组成,且其中存在4个高度保守序列(图2斜黑体部分).说明所
获得基因序列是宁夏枸杞PSY基因.
表1PSY基因编码的蛋白质氨基酸组成
Tab.1TheaminoacidcomponentsofproteinbyPSY
氨基酸数量数量百分比质量百分比氨基酸数{硅数量百分比质量百分比
AminoacidNumberAmountpercentage/%Masspercentage/%AminoacidNumberAmountpercentage/%Masspercentage~%
Ala(A)368.475.72Met(M)143.293.73
Cys(C)71.651.51Asn(N)174.004.们
Asp(D)266.126.18Pro(P)194473.90
Glu(E)276,357,09Gin(Q)l22.82313
Phe(F)143.294.13Arg(R)348.00l057
Gly(G)214942.81Ser(S)337,766.19
His(H)30.710.83Thr(T)184.243.83
Ile(I)225.185.15Val(V)296.826.06
Lys(K)266.126.78Trp(W)71.652.55
Leu(L)409.419.36r(Y)2O4.716.47
l40林业科学42卷
2.3l,基因所编码的蛋白质IGAATTCATGTCTATTTGTACGCTATGGGTTGTTTcGccGAGTTcTGAAGTTTTGAGTGGc
特性分析用Antheprot软件对61
AATGTT
M
TcT
S
GGA
I
Gc
C
cAA
T
Ac轰TTG轰TGc
PSY基因编码的蛋白质的基本NVFLEPIRESYHFSDKSLMY
特性和氨基酸组成进行分析.GGA他c:
∞∞偶TRG"AGGGGG,,TTGGGAG.A
结果为,相对分子质量是48I8lTGAGTTCATTTTGCTTGAGAGAGTCTGGATTAGAGACCCCGGGAAGAAGATTATCGGTA
327,等电点为8.825.在pH7.0241TCCTCCAGTATTATAGCTACCCCGGCAGGAGAAATGACGATGACATCAGAGCAAAAGGTT
H,I,电荷为6.983.蛋白质氨基.TG.cGTTTI
AAA
A
GcAA
T
GAG:
TTTGGATEAAMAG;GTAT
酸的组成分析结果见表I.YDVVLKQAALINRQLRsREN
对PSY基因编码的蛋白质361T
L
GGA
E
GGT
,
GAA
KA;GGATA"GcG:
cG;GAGT:
TGT
进行二级结构预测分析,结果421GA
.TcT代GTA:
TG;:
GGT;ATcTAcTwGGcG
(图3)表明该蛋白富含d一螺旋481ATGACACCGGAGAGGCGTTTAGCTATCTGGGCGATATATGTATGGTGTAGGAGGACAGAT
(helix),高达54.3%,其次无规cGGccG^G^AAcAA∞∞:
G
卷曲(coil),为40%,而0一折叠.
工yDGNAsHINPTALDRwE
601b舢cTAGAAGATGTTTTCAAaGGGC艄CCTTGATAGCITGATGCTGCATCT
(strand)只有5.6%.ARLEDvFKGQPFDMLDAALS
3结论与讨论:
cG
D
GAT
T
GGAITGAGT:
GAvAc;cG.c:
GTMc;T;c
目前已建立多种方法克隆781TATGTGGCTGGTACAGTTGGCTTGATGAGTGTACCAGTAATGGGcATTGCACCTGAATRMDKSRYKNDE
cT
LKFLYLyCy
基因.构建cDNA文库是其中841GA.TGPAVcMGG:
GA;Gc;GG
比较常规的一种.利用探针从KATTESVYNAALSLGIANQL
文库中筛选基因是一件比较烦901ACTAAcc三GGAAA.A.cA
琐的工作,易受假阳性的干扰;96GA
.
TGA
EATTAGG.:
TTTA:
AGTG:
GcAtT;TG:
TAc
而且有时所获取的克隆还不完1021AAATGGAGGATTTTTATGAAGAAGCAAATCAAAAGGGCTAGAAAATTCTATGATGATGCA
整,需要重新筛选.PCR扩增克1081GAK
GAAA
W
G轰GccAGGAAcGT.G:
GTGcAT
隆基因仍是目前最为快速,简便KGVPELSSASRLPVWAALL
1141TTTTATAGAAAAATATTGGAT(;AGATAGAAGCAAATGACTACAACAATTTCACAAAAAGG
的方法.程奇等(1994)和刘建FYRKILD工^NDyNNFTKR
喜等(2001)研究发现在已建立I201GC
ATTATGG:
AT:
AGc;TG,,TAGACATTGCcA;TC:
c
cDNA文库的基础上,利用PCR1261TCTTTTATGATACCCCAAACATGAGCGGCCGC
反应可以快速地克隆cDNA,这.F"Q
在本试验中进一步得到证实.图2宁夏枸杞Ps}基因cDNA序列和由此推导的氨基酸序列
由于PCR反应存在非特异扩Fig?
2Thenucleotidesquen('eandthededucedarTll|li㈣'idsequencfPSYfrom£-barbarum
增,可以通过提高退火温度,增斜黑体字母指高度保守序列.
D~'Jl物长度来提高cDNA序列Th.i".i".'....im..i.i."
的精确性.
PSY催化2个铣牛儿基桡牛儿基焦磷酸(GGPS)缩合形成八氢番茄红素,它是整个类胡萝卜素合成途径
中第1个类胡萝卜素分子.来自其他植物的研究表明PSY是类胡萝卜素生物合成途径中的第1个限速酶
(Welscheta1.,2000),其活性的高低会影响类胡萝卜素的生物合成.季静等(2002)将来自龙胆草(Rabdosia
ternifolia)的5个类胡萝卜素合成酶基因导人烟草,并对转基因烟草中的类胡萝卜素含量进行测定.结果表
明PSY基因对烟草的叶黄素,B一胡萝卜素含量影响较大.因此PSY基因是基因工程的首选目标.枸杞是
我国重要的药用经济林木,总类胡萝卜素含量居植物之首,因此从枸杞中克隆类胡萝卜素合成酶基因对提高
植物中的类胡萝卜素含量可能具有更大的优势.本试验利用PCR技术从宁夏枸杞eDNA文库中成功地分离
了PSY全长cDNA,其核昔酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物具有很高的同源性,分别达到75%和7O%
以上.宁夏枸杞Psl,基因的分离,为通过基因工程方法调控类胡萝},素的代谢和积累,创造类胡萝卜索含
量更高的品系,改善果蔬的营养价值奠定基础
第5期郑阳霞等:
宁夏枸杞八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析l4l
CEEEEEEEECCCCCCCCCCCCCEECCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
MS1C丁LWVVSPSSEVLSGNVFLEPIRESYHFSDKSLMYNGRVKKSRHQRRRSRYGVGDLS
60
CCCCCCCCCCCCCCHHHEEEEEEECCCCCEEEECHHHHHHHHHHHHHCCHHHHCCCEEEC
SFCLRESGLETPGRRLSVsssIlATPAGEMTMTSEQKVYDVVLKQAALlNRQLRSRENLE
120
CCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHCCHHHCCHHHHHHHHHHHHCCC
VKPDIlLPGNANVLNEAYDRCREVCAEYAKSFYWGTQLMTPERRLAIWAIYVWCRRTDEL
180
CCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHHHHHHH
VDGPNASHINPTALDRWEARLEDVFKGQPFDMLDAALSDTITKYPVDlQPFRDMlEGMRM
240
HHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHH
DLKKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMOlAPESKATTESVYNAALSLGIANQLTN
300
HHHHHHHHHHCCCCCCCHHHHHHCCCCHHHHCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
lLRDVGEDARRGRVYLPQDELAQAGLSDEDlFAGKVTDKWRIFMKKQIKRARKFYDDAEK
360
HHHHCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHCCC
GVPELSSASRLPVWAALLFYRKILDE1EANDYNNFTKRAYVNKAKKLLAMPVACAKSLSF
420
CCCCC
MIPQT
425
图3l,基因编码的蛋白质二级结构预测分析
Fig.3SecondarystructurepredictionofproteinbyPSY
H:
Ⅱ一螺旋Helix;C:
无规卷曲Coil;E:
B~折叠Strand.
参考文献
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(责任编辑徐红)
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