甲基化.docx
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甲基化
主要药品、试剂及其试剂的配制
1)1mol/LTris-HCl(pH8.0):
将121.1gTris溶于800mlddH2O中,加浓盐酸调pH到8.0定容至1L。
2)0.5mol/LEDTA(pH8.0):
用800mlddH2O溶解186.1gEDTA-Na2·2H2O,剧烈搅拌。
用NaOH调pH到8.0,约20g。
定容至1L。
3)2%CTAB:
1mol/LTris-HCl(pH8.0)50ml,NaCl40.908g,,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20ml,β-ME2ml,PVP1g,2%CTAB10g,定容至500ml,装入棕色瓶,高压灭菌(注意:
β-ME不可高压灭菌)。
4)氯仿/异戊醇(24:
1):
480ml氯仿+20ml异戊醇。
5)0.1×TE(pH8.0):
1mol/LTris-HCl(pH8.0)100μl,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20μl定容至100ml。
6)5×TBE:
54gTris碱,27.5g硼酸,先加ddH2O溶解,再加40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),定容至1L。
7)3M乙酸钠(pH5.2):
50mlddH2O水中溶解40.8g三水乙酸钠,用冰乙酸调节pH值至5.2,加水定容至100ml,高压灭菌。
8)40%丙烯酰胺(19:
1):
190g丙烯酰胺,10gN’,N’-亚甲基双丙烯酰胺,加ddH2O定容至500ml,4℃保存。
9)10%过硫酸铵(APS):
0.5gAPS,加水至5ml,4℃保存。
10)变性PAGE胶Loadingbuffer:
47.5ml甲酰胺,2mlof0.5MEDTA,溴酚蓝0.125g,二甲苯菁0.125g,定容至50ml。
11)LB培养基:
在950mlddH2O中加入用于细菌培养的胰化蛋白胨l0g,细菌培养用酵母提取物5g,NaCl10g,摇动容器直至完全溶解,用5mol/LNaOH(约0.2mL)调节PH值至7.0,加入ddH2O至总体积1L,在1.034x105Pa高压下蒸汽灭菌20min。
固体LB还需加入15g琼脂粉。
植物基因组DNA的提取与纯化(改良的CTAB法):
1)取新鲜叶片放入1.5ml离心管,加液氮研磨成粉末状;
2)加600μl预热的(65℃)2%CTAB,摇匀后,置65℃水浴中1h。
期间,倒转离心管数次,1h后从水浴中拿出,冷却至室温;
3)加600μl氯仿/异戊醇(24:
1)混匀,12000rpm离心10min(室温);
4)小心吸取上清,加入到含有2倍体积预冷(-20℃)无水乙醇的1.5ml离心管中,充分静置至白色絮状沉淀出现;
5)用白色枪头挑出沉淀,放入1.5ml离心管中,用70%的乙醇(500μl)冲洗两次,再用无水乙醇冲洗一次,自然干燥;
6)加入200μl0.1×TE溶解DNA;
7)加入1μlRNase(10mg/ml),37℃水浴1h后冷却;
8)加入500μl氯仿/异戊醇(24:
1)充分混匀后,12000rpm离心10min(4℃);
9)小心吸取上清,加入到已加入2倍体积预冷(-20℃)无水乙醇和1/10体积3M乙酸钠(pH5.2)的1.5ml离心管中,充分静置至沉淀出现;
10)12000rpm离心10min(4℃),小心倒去乙醇,用70%的乙醇冲洗沉淀两次后再用无水乙醇冲洗一次,自然干燥;
11)最后,加入100μl0.1×TE充分溶解,取部分溶液用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法检测DNA的浓度和纯度,最后置于-20℃冰箱中保存备用。
DNA的鉴定
DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。
因此,可以在260nm波长下进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
如用1cm光径,用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:
DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。
若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。
。
将DNA样品稀释200倍,测得在波长260nm和280nm下的吸光值及其比率。
计算出样品DNA稀释前的浓度,结合琼脂糖凝胶电泳检测结果,将样品DNA稀释到50ng/μl,用于酶切。
2.DNA的MSAP(甲基化敏感扩增片段长度多态性)分析
MSAP实验主要包括以下几个环节:
基因组DNA双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测、记带和数据整理等。
2.1限制性酶切及连接
选取一对对甲基化敏感的同位酶HpaⅡ/MspⅠ分别与限制性内切酶EcoRⅠ进行组合(E+H,E+M),对基因组DNA进行双酶切和连接。
(adapters序列见表2)
酶切体系:
DNA(50ng/μl)
10.0μl
EcoRⅠ(10U/μl)
1.0μl
HpaⅡ/MspⅠ(10U/μl)
1.0μl
10×buffer
5.0μl
ddH2O
33.0μl
total
50.0μl
37℃酶切8h,65℃10min终止反应,取12.5μl酶切产物用于连接。
连接体系:
HpaⅡ/MspⅠadapter(50μM)
1.0μl
EcoRⅠadapter(5μM)
1.0μl
T4buffer(10×)
5.0μl
T4连接酶(5U/μl)
0.5μl
酶切产物
12.5μl
ddH2O
30.0μl
total
50.0μl
16℃连接过夜,65℃10min终止反应,将部分连接液稀释6倍用于预扩增反应。
2.2预扩增(预扩增引物见表2)
预扩增反应体系如下:
稀释6倍的连接液
1.0μl
10×buffer
2.5μl
Mg2+(25mM)
1.5μl
dNTP(10mM)
0.4μl
E+A(50μM)
1.0μl
H/M+T(50μM)
1.0μl
Taq酶(5U/μl)
0.4μl
ddH2O
17.2μl
total
25.0μl
PCR预扩增程序:
1.94℃4min
2.94℃30sec
3.56℃30sec
4.72℃lmin
5.Goto2for25cycles
6.72℃10min
7.12℃forever
预扩增产物检测
取10μl产物在1.4%琼脂糖凝胶上检测,100V电压30min左右,如果在100-500bp之间产生均匀的弥散为理想的扩增效果,根据弥散的亮度确定稀释的倍数,通常稀释30倍。
2.3选择性扩增(所用引物见表3)
选择性扩增体系如下:
稀释50倍的预扩产物
3.0μl
10×buffer
2.5μl
Mg2+(25mM)
1.5μl
dNTP(10mM)
0.3μl
Taq酶(5U/μl)
0.4μl
E+3(50ng/μl)
1.0μl
H/M+3(50ng/μl)
1.0μl
ddH2O
15.3μl
total
25.0μl
PCR扩增程序:
1.94℃for4min
2.94℃for30sec
3.65℃for30secreduceby0.7℃percycle
4.72℃for1min
5.Gotostep2for12cycles
6.94℃for30sec
7.56℃for30sec
8.72℃for1min
9.Gotostep6for23cycles
10.72℃for10min
11.12℃forever
表1MSAP所用接头、预扩引物及选扩引物序列
Table1Sequenceofadaptersandprimersofpre-amplificationandalternativeamplificationusedforMSAPanalysis
编号
序列(5’-3’)
接头
EcoRⅠ-adapter1
CTCGTAGACTGCGTACC
EcoRⅠ-adapter2
AATTGGTACGCAGTCTAC
HpaⅡ/MspⅠ-adapter1
GATCATGAGTCCTGCT
HpaⅡ/MspⅠ-adapter2
CGAGCAGGACTCATGA
预扩引物
E+A
GTAGACTGCGTACCAATTCA
H/M+T
ATCATGAGTCCTGCTCGGT
选扩引物
E01
GACTGCGTACCAATTCAAC
E02
GACTGCGTACCAATTCACA
E03
GACTGCGTACCAATTCACT
E04
GACTGCGTACCAATTCACC
E05
GACTGCGTACCAATTCACG
E06
GACTGCGTACCAATTCAGC
E07
GACTGCGTACCAATTCAGG
E08
GACTGCGTACCAATTCAGT
E09
GACTGCGTACCAATTCAAG
H01
ATCATGAGTCCTGCTCGGTTC
H02
ATCATGAGTCCTGCTCGGTCG
H03
ATCATGAGTCCTGCTCGGTGT
H04
ATCATGAGTCCTGCTCGGTGA
H05
ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA
2.4PCR产物检测
2.4.1检测前PCR产物变性处理(用于银染体系)
反应结束后20μl体系加入大约15μlLoadingbuffer,95℃5min后迅速将PCR管置于冰上,用于电泳分析。
2.4.2变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)玻璃板的准备:
首先用清洗液将电泳槽两块玻璃板洗净,蒸馏水冲洗后用酒精擦干。
注意:
洗板时长板和短板应分开,避免相互污染。
(2)涂板:
将硅化剂均匀的涂在短板,反硅化剂涂在长板,放置5min后将长板和短板装配好;在涂板过程中,应避免两种溶液相互污染。
(3)凝胶配制:
6%变性聚丙烯酰胺凝胶(80ml):
33.6g尿素,5xTBE8ml,ddH2032ml,40%聚丙烯酰胺溶液12ml,过滤。
灌胶前,加入凝胶总体积0.05%四甲基乙二胺(TEMED),0.5%的浓度为10%过硫酸按(APS),混匀后倒胶并将梳子插入适当位置,待胶聚合2小时后电泳。
(4)电泳:
将梳子小心拔出,将插梳子的一端清洗干净,必要时用洗瓶冲洗插梳子处。
将玻璃板外面擦干,以防电泳时短路或漏电。
将板装到电泳槽中,加入0.5×TBE电泳缓冲液,用移液器将梳子处的气泡赶出,将梳子轻轻插入,其深度为刚进入胶面。
使用ThermoEC160公司的DNA测序电泳装置,60W恒功率预电泳30min,让凝胶温度达45℃后上样,上样量为4μl,恒功率80W电泳2小时。
(5)凝胶银染
a.漂洗:
将玻璃板从电泳槽取下,拔出梳子,并轻轻将长板取下,放入1.5L蒸馏水中,漂洗30sec。
b.染色:
在1.5L蒸馏水中加入3g硝酸银,染色30min。
注意硝酸银应该充分溶解;如多次使用,则需避光保存。
c.漂洗:
染色完毕后,在蒸馏水中迅速漂洗20sec。
d.显色:
漂洗后,转入1.5L显色液中(其中含有30gNaOH,0.6gNa2CO3,6ml甲醛),在摇床上显影至条带清晰,大约需要10-15min。
e.漂洗1-2min,晾干,照相。
2.2.3.4.3记带及分析
将在凝胶上显示清晰的谱带进行记载,对于每一材料在同一位点有带则记为“1”,无带则记为“0”,记录所有的引物组合的谱带用于计算分析。
2.5目的片段的回收、克隆及测序
2.5.1差异片段回收
将聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到的差异片段用刀片切下放入1.5ml离心管,加20μl0.1×TE,沸水煮10min,12000rpm离心2min,取2μl上清作为PCR的模板,按照原MSAP选择性扩增程序和引物组合进行扩增,将所得PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,切割目的带进行纯化。
2.5.2差异DNA片段的纯化
PCR产物纯化使用广东东盛琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,操作按照说明书进行。
操作步骤如下:
1.通过把切取含DNA片段的琼脂糖凝胶装在1.5ml离心管中,称其重量近似地确定其体积,每100mg琼脂糖凝胶相当于100μl体积,称量每次切取含DNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的BD溶液。
2.55℃-65℃水浴7-10min,直至胶完全融化,期间振荡3次,琼脂糖必须完全融化(如果体积大于500μl,可适当增加融胶时间,若此时溶液变红,可加10μl3MNaAC(PH5.0))。
3.将溶液置于DNA纯化柱中,静置2min,12000rpm离心60sec,若一次加不完,可分两次离心,弃滤液。
4.加入500μlPE溶液(初次使用前用无水乙醇按1:
4稀释)于离心柱中12000rpm,离心60sec,弃滤液。
5.用溶液PE(初次使用前用无水乙醇按1:
4稀释)500μl再洗一遍,12000rpm离心60sec。
12000rpm再次离心2min,以甩干剩余液体。
(注:
此步对获得较好的DNA产量十分重要)
6.将离心柱置于新的离心管中,加入60℃预热的30-100μl溶液Eluent于纯化柱中(硅胶模中央),静置2min,12000rpm离心60sec,管底即为回收的DNA。
7.将DNA贮存于-20℃。
2.5.3差异片段克隆
(1)连接
取2u1经纯化的PCR产物用于连接反应,使用Promega公司生产的pMD-18TVectorCloningKit进行,按载体/插入片段1:
3的比例直接克隆到pMD-18T载体中,总反应体积为10μl。
16℃,连接1.5h。
(2)感受态细胞的制备
使用大肠杆菌菌株DH5α为受体菌。
取-70℃保存的菌种10μl转入l0mlLB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
然后取2m1过夜培养物转入40m1LB液体培养基中于37℃振荡培养约两小时,至OD550nm=0.3。
将培养物于7000rpm离心2min收集细胞。
之后在冰上用1/2体积(20m1)预冷的0.05mo1/LCaCl2重悬细胞,置于冰上20min后于7000rpm离心2min收集细胞。
然后将细胞重悬于1/10体积(4m1)预冷的0.05mo1/LCaCl2,此时的细胞即可用于转化。
(3)感受态细胞的转化及α互补筛选
取30μl感受态细胞,冰浴10分钟。
在无菌条件下加入3μl连接产物,轻旋混匀后置于冰上30min。
42℃水浴热击细胞90sec(不摇动),立即置冰上3-5min,加400μl液体LB(不含Amp),37℃,150rpm,50min;离心,去上清,取100-150μl培养液涂于表面涂有X-gal和IPTG的Amp-LB平板上,37℃恒温培养12-16小时,至菌落长至直径为1-2mm,然后每个平板随机挑取若干透明白斑(单菌落),于1ml含Amp的液体LB中,37℃,摇过夜。
(4)菌液的PCR检测
利用原引物对菌液进行扩增。
反应体系如下:
菌液DNA1μl
dNTP(10mM)0.3μl
Taq酶(5U/μl)0.4μl
10×buffer2.0μl
E+3(50μM)1μl
H/M+3(50μM)1μl
ddH2O14.3μl
total20μl
PCR采用选择性扩增程序,扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶检测。
(5)菌液保存
在每管菌液中,加450μl经过高压灭菌的50%的甘油,混匀,吸取200μl于新的1.5ml离心管中用于测序,剩余的-70℃保存。
2.5.4测序及序列分析
阳性克隆菌液由英骏生命科技有限公司进行测序。
所得序列结果在NCBI网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)方法对nr数据库(GenBank+EMBL+DDBJ+PDB)进行同源性探寻。
DNA提取质量检测
酶切和预扩、选扩检测
50ul的酶切体系中,用2组酶分别对100、300、500、700ng基因组DNA进行8小时酶切,琼脂糖电泳检测结果如图3-2,可以看到经过8小时酶切含量为700ngDNA的体系仍然有大量在2000b以上的大片段,酶切不完全;含量为300和500ng的体系电泳显示为均匀弥散的带,而含量为100ng的体系电泳后则几乎看不见DNA。
为了能直观看到酶切效果和操作方便,正式实验时选择含有500ngDNA的50ul酶切体系。
图3-2不同模板DNA用量酶切结果
注:
H:
HpaⅡ+EcoRⅠ酶切,M:
MspⅠ+EcoRⅠ酶切,以下同。
M:
分子量标准DL2000
Fig.3-2resultofdigestionwithdifferenttemplateamount
note:
H:
digestionwithHpaⅡandEcoRⅠ,M:
digestionwithMspⅠandEcoRⅠ.
M:
MarkerDL2000
本实验在利用连接产物作为模板进行预扩增时,对模板的用量进行了探索。
将分别稀释6、10、20倍的连接产物及连接产物原液各加入25ul的预扩体系中进行预扩增,产物琼脂糖电泳检测结果如图3-3。
各浓度结果比较相似,片段基本都分布在100~1200bp之间,在接近500bp处有一条较亮的带。
正式实验时选择稀释6倍的连接产物作为预扩增模板。
图3.3连接产物不同稀释倍数对预扩影响
Fig.3.3Theeffectofdilutionratiosofligationproducton
pre-amplificationreaction
将预扩产物分别稀释10、20、30、40倍后各取3ul加入25ul选扩体系进行选择性扩增,产物琼脂糖电泳检测结果如图3-4,可以看到各体系在400bp左右均有一明亮的带。
在稀释倍数为10倍和20倍时,各自2组酶切体系至少一组在1200bp处产生明显的带,而在400~1200bp之间比较暗,片段较少。
利用稀释10倍和20倍的预扩产物进行选扩的结果相似。
正式实验时选择稀释30倍的预扩产物作为选择性扩增模板。
图3-4预扩产物不同稀释倍数对选扩影响
Fig.3-4theeffectofdilutionratiosofpre-amplificationproducton
selectiveamplificationreaction
3.1.3变性PAGE电泳结果
图3-5选扩产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
注:
A、B、C、D分别代表自交系Z-1-4、81-3、Y-106-5、70-1;1、2、3表示低温处理0、4、24h;以下同。
Fig.3-5thedetectionofselectiveamplificationproductbyPAGEelectrophoresis
Note:
A,B,C,andDrepresentsinbredlineZ-1-4,81-3,Y-106-5,and70-1,separately;1、2、3representschillingfor0,4,24h.
将选扩产物变性后在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳约1.5h,染色,得到比较清晰的谱带,结果如图3-5。
各样品电泳条带差异较小,说明酶切一致性好,可避免因为酶切控制不好造成阴性差异条带过多,从而导致后续验证工作量增加。
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