滨刺芹乙醇提取物石油醚段有效活性成分的分离和鉴定doc.docx
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滨刺芹乙醇提取物石油醚段有效活性成分的分离和鉴定doc
XX大学
毕业论文
题目:
滨刺芹乙醇提取物石油醚段
有效活性成分的分离和鉴定
学号:
XX
姓名:
XX
年级:
2006级
学院:
材料与化工学院
系别:
化工系
专业:
化学工程与工艺
指导教师:
XX
完成日期:
X年X月X日
摘要
滨刺芹(Seaholly),是一种在实用和药用方面用途都比较广泛的天然产物,鉴于目前国内外对滨刺芹的研究还不够深入,为了研究其有效活性成分的化学组成,从而发掘其潜在的价值和功用,本论文从当代的分离和鉴定技术发展情况展开讨论,结合中国的国情和实验室的条件,实验采用硅胶柱色谱和薄层色谱等分离方法,对滨刺芹乙醇提取物石油醚萃取部分的有效活性成分进行了分离提纯,在进行了多次纯化分析之后,得到了一些比较纯的物质,但是由于量都比较少,加上自己经验不足,以及实验室条件等多种因素的限制,未能鉴定出所得样品的结构,只得到一个样品的核磁共振氢谱图,对于其他未能鉴定的物质,在条件允许的情况下,可以尝试通过制备色谱法来鉴定其结构,而实验中分离出的其他不纯物质,可以做进一步的实验,以待做出更佳的结果。
关键词:
滨刺芹;提取;分离;鉴定
Abstract
Seahollyisakindofnaturalproductwhichusedmoreextensiveinpracticalandmedicinal.Asthecurrentofdomesticandoverseasresearchonseahollyisnotincisiveenough,Inordertostudythechemicalcompositionoftheactiveingredients,anddiscoveritspotentialvalueandfunction.Thisthesisdiscussesfromthecontemporarydevelopmentsinseparationandidentificationtechnology.CombinedwithChina'snationalconditionsandourlaboratoryconditions,weusedSilicagelcolumnchromatographyandTLCandsomeothermethods.TheactivecompoundsfromthepetroleumetherfractionofethanolextractoftheSeahollywereseparatedandpurified.Wehavegotsomepuresubstances.However,becauseoflessquality,lackofexperience,laboratoryconditionsandotherfactors,Ihaven'tidentifiedthestructuresofthesamples,Justgetaprotonmagneticresonancespectroscopyofasample,andwillberesolvedspectrum.Forothersubstanceswhichwerenotidentified,wecantrytopreparechromatographytoidentifythestructureIntheconditionallows.Someimpuritieswhichgotfromtheexperiments,wecandofurtherexperiments,pendingtheresultstomakebetter.
Keywords:
Seaholly;extraction;separation;identification
目录
1.前言……………………………………………………………………
(1)
2.分离纯化新技术的进展…………………………………………………
(1)
2.1.超临界流体萃取技术……………………………………………
(1)
2.2.膜分离技术………………………………………………………
(2)
2.3.高速逆流色谱分离技术…………………………………………
(2)
2.4.高效毛细管电泳法………………………………………………
(2)
2.5.制备高效液相色谱………………………………………………(3)
2.6.分子印迹技术……………………………………………………(3)
2.7.半仿生提取技术…………………………………………………(3)
2.8.酶工程技术………………………………………………………(3)
2.9.微波技术…………………………………………………………(4)
2.10.超声提取技术……………………………………………………(4)
2.11.分子蒸馏技术……………………………………………………(4)
3.色谱分离分析方法……………………………………………………(5)
3.1.红外光谱…………………………………………………………(5)
3.2.紫外光谱…………………………………………………………(6)
3.3.核磁共振…………………………………………………………(6)
3.4.质谱分析…………………………………………………………(7)
3.5.热重分析…………………………………………………………(8)
3.6.气相色谱和色谱理论……………………………………………(9)
3.7.高效液相色谱……………………………………………………(9)
3.8.色谱新方法………………………………………………………(10)
3.9.结论………………………………………………………………(10)
4.实验部分………………………………………………………………(11)
4.1.仪器设备与试剂…………………………………………………(11)
4.2.实验原理…………………………………………………………(13)
4.2.1.柱色谱分离原理及条件……………………………………(13)
4.2.2.薄层色谱原理及条件………………………………………(14)
4.3.相关操作介绍……………………………………………………(18)
4.3.1.柱色谱分离操作……………………………………………(18)
4.3.2.薄层色谱操作………………………………………………(19)
4.4.实验操作步骤……………………………………………………(20)
4.4.1.准备阶段……………………………………………………(20)
4.4.2.乙醇提取阶段………………………………………………(20)
4.4.3.萃取阶段……………………………………………………(21)
4.4.4.色谱柱a分离阶段…………………………………………(21)
4.4.5.色谱柱b分离阶段…………………………………………(21)
4.4.6.色谱柱c分离阶段…………………………………………(22)
4.4.7.色谱柱d分离阶段…………………………………………(23)
4.4.8.色谱柱e分离阶段…………………………………………(24)
4.5.最终样品的鉴定分析……………………………………………(26)
5.总结与讨论……………………………………………………………(26)
5.1.关于分离纯化……………………………………………………(26)
5.2.关于实验结果……………………………………………………(26)
致谢………………………………………………………………………(28)
参考文献…………………………………………………………………(29)
附件一:
样品d1-4核磁共振氢谱图(总图)……………………………(32)
附件二:
样品d1-4核磁共振氢谱图(局部放大图)……………………(33)
1.前言
滨刺芹,俗名野香菜,英文名Seaholly,二年生或生命短的多年生草本植物。
生于沙质土壤、向阳处及海岸附近。
其叶质地坚硬,具刺;花为金属蓝色,夏季开放。
其幼叶、芽、嫩枝均可食用。
秋天的根中富含矿物质,可为蔬菜和蜜饯调味,也可加糖煮,是18世纪受人喜爱的滋补品、咳嗽药和春药。
根制成糊药可促进组织再生;根煎汁可治疗膀胱炎、尿道炎及前列腺疾病[1]。
图1-1滨刺芹[1]
迄今为止,国内外对滨刺芹的研究仍处于初级阶段,用途也只限于最基础的药用和食用方面,很少有人对其作过更深入的研究,故而其体内的化学成分值得我们去探寻一番。
因此,选此课题就是为了研究滨刺芹有效活性成分的化学组成,从而为将来对滨刺芹的深加工和综合利用打下基础,促进其在药理、临床等方面未知利用价值的研究,所以,做好本课题对将来的研究有深远的影响。
天然产物是药物研发中极具潜力的原料资源,分离纯化天然产物中具有独特生物活性的物质是中药研究的重要基础工作。
天然产物有效成分复杂,含量低,难于富集,用传统的分离方法不仅步骤繁琐,能源及材料消耗大,而且产率及纯度不高,尤其难以分离结构和性质相似的组分。
随着中药现代化的发展,高新技术不断在天然药物中推广应用。
2.分离纯化新技术的进展
2.1.超临界流体萃取技术
超临界流体萃取是一种以超临界流体代替常规有机溶剂对中药有效成分进行萃取和分离的新型技术。
超临界流体是温度与压力均在其临界点之上的流体,性质介于气体和液体之间,有与液体相接近的密度,与气体相接近的黏度及高的扩散系数,故具有很高的溶解能力及好的流动、传递性能,可代替传统的有毒、易燃、易挥发的有机溶剂[2]。
超临界流体萃取技术在中药生产领域应用较多。
目前,通过调节温度、压力、加入适宜夹带剂等方法,已成功地从中药中提得挥发油、生物碱、苯内素、黄酮类、有机酚酸、苷类、萜类以及天然色素等成分。
这项技术不仅可提高提取效率,还可大量保存热不稳定及易氧化成分,可提取含量低的成分,以及选择性地提取目标产品[3]。
2.2.膜分离技术
膜分离技术以选择性透过膜为分离递质,当膜两侧存在某种推动力(如压力差、浓度差、电位差等)时,原料侧组分选择性的透过膜,以达到分离、提纯目的。
膜分离技术具有过程简单、无相变、分离系数大、节能、高效、无二次污染、可常温连续操作、可直接放大等优点,是一项高新技术。
膜分离技术在中药领域中的应用将推动中药现代化发展进程,同时还能提高我国中药的附加值,有利于中药出口。
可以展望,膜分离技术必将在21世纪推动中药制药工业的迅速发展,为社会带来巨大的经济效益和社会效益[4]。
2.3.高速逆流色谱分离技术
高速逆流色谱分离法是一种不用任何固态载体或支撑体的液液分配色谱技术,该技术分离效率高,产品纯度高,不存在载体对样品的吸附和污染,具有制备量大和溶剂消耗少等优点,可广泛应用于生物工程、医学、医药、化工、食品等领域。
近年高速逆流色谱分离法在天然药物研究领域独具特色。
王凤美等用高速逆流色谱法制备丹酚酸B化学对照品,所用的溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-水-甲醇(1.5∶5∶5∶1.5),一次分离可制备63.4mg丹酚酸B,纯度为98.16%,同步完成复杂样品的分离、纯化和制备[5]。
2.4.高效毛细管电泳法
高效毛细管电泳法是近年来迅速发展的一种新型分离分析技术,以高质电场为驱动力以毛细管为分离通道依据样品中各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现的类液相分离技术。
该技术用于分析中草药,具有以下优势:
分离模式多,适合于中草药中存在的各类物质的分析;简化对样品前处理的要求;分析时间一般比HPLC短;由于柱效高,有可能使同一个分离条件适合多种样品中多组分的分析;HPCE所采用的毛细管柱易于全面清洗,不必担心柱污染而报废;所用的化学试剂少,价廉,分析成本低,特别适合于我国国情[6]。
2.5.制备高效液相色谱
制备高效液相色谱具有灵敏度高、分析速度快、选择性强等特点,可一次性完成分离纯化和鉴定,广泛用于天然产物的分离制备。
董新荣等利用制备型反相高效液相色谱法从辣椒素类物质中制备了3种辣椒素单体[7]。
确认它们分别为降二氢辣椒素、辣椒素和二氢辣椒素,收率分别为60.1%、58.9%和72.3%。
2.6.分子印迹技术
分子印迹技术是20世纪末出现的一种高选择性分离技术,模仿了生物界的锁匙作用原理,首先合成对已知结构的模板分子具有特定识别能力的分子印迹聚合物(MIP),MIP能结合与模板分子结构相同或类似的分子,而对于与模板分子结构相差较远的分子只有较弱的表面吸附作用,从而将两者分离,富集得到目标化合物。
MIP除了可以快速有效地分离出目标化合物,还能获得具有相似药理作用的相似化合物[8]。
2.7.半仿生提取技术
半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合,从生物药剂学角度模拟口服给药及药物经胃肠道转运的原理,为经消化道给药的中药制剂设计的一种新的提取工艺。
张学兰等以小檗碱、总生物碱、干浸膏量为指标,对黄柏的半仿生提取法和水提取法进行了比较[9]。
结果显示,半仿生提取法在增加有效成分的提取率、提高某些药效学指标方面明显优于水提法,是一种值得在中药提取分离中推广的好方法。
2.8.酶工程技术
酶工程技术是近几年来用于中药工业的一项生物工程技术。
中草药成分复杂,有各种有效成分,选用恰当的酶,可以通过酶反应较温和地将植物组织分解,加速有效成分的释放提取,选用相应的酶可将影响液体制剂的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解祛除,也可促进某些极性低的脂溶成分转化为糖苷类易溶于水成分而有利于提取[10]。
2.9.微波技术
微波萃取是利用微波来提高萃取率的一种最新发展起来的新技术,具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高的特点,被应用于环保方面有机污染物的提取、中药及天然化合物的生物活性成分提取等方面。
对于植物果胶的提取,与传统的方法相比,微波辐射能大大加快组织的水解,使果胶提取的时间由传统方法的90min缩短到5min,果胶质量有所提高[11]。
2.10.超声提取技术
超声提取技术的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出、提取;另外,超声波的次级效应,如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并使之充分与溶剂混合,利于提取。
其热效应、机械粉碎作用及空化作用成为超声技术在中药提取法应用中的三大理论依据。
与常规提取法相比,超声波提取速度快、时间短、收率高,并免去了高温对提取成分的影响,已被许多中药分析过程选为样品处理的手段。
陈洪涛等研究超声提取榕树叶总黄酮的工艺条件,结果表明该方法效率高,稳定性好,提取总黄酮含量高[12]。
2.11.分子蒸馏技术
分子蒸馏是在高真空度下进行分离操作的连续蒸馏,可使分离混合物的沸点远低于常压,各组分在系统中受热停留时间短,因此适于分离沸点高、黏度大、热敏性的天然物料。
翟淑红等利用分子蒸馏技术对茶树油进行精制,结果从粗茶树油中分离出了61种化合物,鉴定出36种组分,占总量的98.67%,其中4-松油醇高达49.56%,并且精制的茶树油符合国际标准[13]。
分子蒸馏技术目前面临的主要课题是扩大应用领域,尤其是对一些分离难度大的天然药物的应用。
许多研究表明,以上这些新技术在天然药物提取分离方面具有广泛的应用前景。
现代化提取分离技术的应用对提高天然药物制剂质量,加快新药开发和中药现代化起着至关重要的作用。
3.色谱分离分析方法
3.1. 红外光谱
红外光谱(Infraredspectra),以波长或波数为横坐标,以强度或其他随波长变化的性质为纵坐标所得到的反映红外射线与物质相互作用的谱图。
按红外射线的波长范围,可粗略地分为近红外光谱(波段为0.8~2.5um)、中红外光谱(2.5~25um)和远红外光谱(25~1000um)。
对物质自发发射或受激发射的红外射线进行分光,可得到红外发射光谱,物质的红外发射光谱主要决定于物质的温度和化学组成;对被物质所吸收的红外射线进行分光,可得到红外吸收光谱。
每种分子都有由其组成和结构决定的独有的红外吸收光谱,它是一种分子光谱。
分子的红外吸收光谱属于带状光谱。
原子也有红外发射和吸收光谱,但都是线状光谱[14]。
量子场论或量子电动力学可以正确地描述和解释红外射线(一种电磁辐射)与物质的相互作用。
若采用半经典的理论处理方法,即对组成物质的分子和原子作为量子力学体系来处理,辐射场作为一种经典物理中的电磁波并忽略其光子的特征,则分子红外光谱是由分子不停地作振动和转动而产生的。
分子振动是指分子中各原子在平衡位置附近作相对运动,多原子分子可组成多种振动模式。
当孤立分子中各原子以同一频率、同一相位在平衡位置附近作简谐振动时,这种振动方式称简正振动。
含N个原子的分子应有3N-6个简正振动方式;如果是线性分子,只有3N-5个简正振动方式。
图中示出非线性3原子分子仅有的3种简正振动模式。
分子的转动指的是分子绕质心进行的运动。
分子振动和转动的能量不是连续的,而是量子化的。
当分子由一种振动(或转动)状态跃迁至另一种振动(或转动)状态时,就要吸收或发射与其能级差相应的光[15]。
研究红外光谱的方法主要是吸收光谱法。
使用的光谱有两种类型。
一种是单通道或多通道测量的棱镜或光栅色散型光谱仪,另一种是利用双光束干涉原理并进行干涉图的傅里叶变换数学处理的非色散型的傅里叶变换红外光谱仪。
红外光谱具有高度的特征性,不但可以用来研究分子的结构和化学键,如力常数的测定等,而且广泛地用于表征和鉴别各种化学物种。
3.2.紫外光谱
紫外光谱是分子中某些价电子吸收了一定波长的电磁波,由低能级跃近到高能级而产生的一种光谱,也称之为电子光谱.目前使用的紫外光谱仪波长范围是200~800nm.其基本原理是用不同波长的近紫外光(200~400nm)依次照一定浓度的被测样品溶液时,就会发现部分波长的光被吸收。
如果以波长λ为横坐标(单位nm),吸收度(absorbance)A为纵坐标作图,即得到紫外光谱(ultravioletspectra,简称UV).
通常有机分子处于基态,电子填入成键或非键轨道。
但有机分子吸收UV后,则受激变为激发态,电子进入反键轨道。
由图可知:
可能的电子跃迁有6种。
但实际上,由跃迁能级差和跃迁选律所决定,几乎所有的UV吸收光谱都是由π-π*跃迁或n-π*跃迁所产生的,且n-π*跃迁一般都是弱吸收(ε<100)[16]。
3.3.核磁共振
核磁共振成像(NuclearMagneticResonanceImaging,NMRI),又称磁共振成像(MagneticResonanceImaging,MRI),
核磁共振全名是核磁共振成像(NuclearMagneticResonanceImaging,简称NMRI),又称自旋成像(spinimaging),也称磁共振成像(MagneticResonanceImaging,简称MRI),是磁矩不为零的原子核,在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂,共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。
核磁共振波谱学是光谱学的一个分支,其共振频率在射频波段,相应的跃迁是核自旋在核塞曼能级上的跃迁。
核磁共振是处于静磁场中的原子核在另一交变磁场作用下发生的物理现象。
通常人们所说的核磁共振指的是利用核磁共振现象获取分子结构、人体内部结构信息的技术。
并不是是所有原子核都能产生这种现象,原子核能产生核磁共振现象是因为具有核自旋。
原子核自旋产生磁矩,当核磁矩处于静止外磁场中时产生进动核和能级分裂。
在交变磁场作用下,自旋核会吸收特定频率的电磁波,从较低的能级跃迁到较高能级。
这种过程就是核磁共振。
核磁共振(MRI)又叫核磁共振成像技术。
是继CT后医学影像学的又一重大进步。
自80年代应用以来,它以极快的速度得到发展。
其基本原理:
是将人体置于特殊的磁场中,用无线电射频脉冲激发人体内氢原子核,引起氢原子核共振,并吸收能量。
在停止射频脉冲后,氢原子核按特定频率发出射电信号,并将吸收的能量释放出来,被体外的接受器收录,经电子计算机处理获得图像,这就叫做核磁共振成像[17]。
核磁共振是一种物理现象,作为一种分析手段广泛应用于物理、化学生物等领域,到1973年才将它用于医学临床检测。
为了避免与核医学中放射成像混淆,把它称为核磁共振成像术(MRI)。
MRI是一种生物磁自旋成像技术,它是利用原子核自旋运动的特点,在外加磁场内,经射频脉冲激后产生信号,用探测器检测并输入计算机,经过处理转换在屏幕上显示图像。
MRI提供的信息量不但大于医学影像学中的其他许多成像术,而且不同于已有的成像术,因此,它对疾病的诊断具有很大的潜在优越性。
它可以直接作出横断面、矢状面、冠状面和各种斜面的体层图像,不会产生CT检测中的伪影;不需注射造影剂;无电离辐射,对机体没有不良影响。
MRI对检测脑内血肿、脑外血肿、脑肿瘤、颅内动脉瘤、动静脉血管畸形、脑缺血、椎管内肿瘤、脊髓空洞症和脊髓积水等颅脑常见疾病非常有效,同时对腰椎椎间盘后突、原发性肝癌等疾病的诊断也很有效。
MRI也存在不足之处。
它的空间分辨率不及CT,带有心脏起搏器的患者或有某些金属异物的部位不能作MRI的检查,另外价格比较昂贵[18]。
3.4.质谱分析
质谱分析(MassSpectraAnalysis)是一种测量离子荷质比(电荷-质量比)的分析方法,其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离,生成不同荷质比的带正电荷的离子,经加速电场的作用,形成离子束,进入质量分析器。
在质量分析器中,再利用电场和磁场使发生相反的速度色散,将它们分别聚焦而得到质谱图,从而确定其质量。
第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯·阿斯顿于1919年制成的。
出手不凡,阿斯顿用这台装置发现了多种元素同位素,研究了53个非放射性元素,发现了天然存在的287种核素中的212种,第一次证明原子质量亏损。
他为此荣获1922年诺贝尔化学奖。
近年来质谱技术发展很快。
随着质谱技术的发展,其应用领域也越来越广。
由于质谱分析具有灵敏度高,样品用量少,分析速度快,分离和鉴定同时进行等优点,因此,质谱技术广泛的应用于化学,化工,环境,能源,医药,运动医学,刑侦科学,生命科学,材料科学等各个领域。
质谱仪种类繁多,不同仪器应用特点也不同,一般来说,在300C左右能汽化的样品,可以优先考虑用GC-MS进行分析,因为GC-MS使用EI源,得到的质谱信息多,可以进行库检索。
毛细管柱的分离效果也好。
如果在300C左右不能汽化,则需要用LC-MS分析,此时主要得分子量信息,如果是串联质谱,还可以得一些结构信息[19]。
如果是生物大分子,主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析,主要得分子量信息。
对于蛋白质样品,还可以测定氨基酸序列。
质谱仪的分辨率是一项重要技术指标,高分辨质谱仪可以提供化合物组成式,这对于结构测定是非常重要的。
双聚焦质谱仪,傅立叶变换质谱仪,带反射器的飞行时间质谱仪等都具有高分辨功能。
质谱分析法对样品有一定的要求。
进行GC-MS分析的样品应是有机溶液,水溶液中的有机物一般不能测定,
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