第一节HPLC在链格孢菌毒素提取过程中的应用.docx
- 文档编号:17313007
- 上传时间:2023-07-24
- 格式:DOCX
- 页数:94
- 大小:488.60KB
第一节HPLC在链格孢菌毒素提取过程中的应用.docx
《第一节HPLC在链格孢菌毒素提取过程中的应用.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第一节HPLC在链格孢菌毒素提取过程中的应用.docx(94页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
第一节HPLC在链格孢菌毒素提取过程中的应用
硕士学位论文
链格孢菌代谢毒素AAC-toxin检测及其除草生物活性的评价
魏冉
指导教师
强胜教授
专业名称
植物学
研究方向
生物除草剂
答辩日期
二○○九年六月
TESTANDBIOASSAYOFHERBICIDALACTIVITYOFALTERNARIAALTERNATAAAC-TOXIN
By
WEIRAN
ATHESIS
SUBMITTEDTO
NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY
INPARTICALFUFILMENTOFTHEREQUIRMENTS
FORTHEMASTERDEGREEOFSCIENCE
SUPERVISEDBY:
PROFESSORQIANGSHENG
WEEDRESEARCHLABORATORY
COLLEGEOFLIFESCIENCE
NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITY
NANJING210095,P.R.CHINA
JUNE2009
原创性声明
本人郑重声明:
所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者(需亲笔)签名:
年月日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。
本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
保密□,在年解密后适用本授权书。
本学位论文属于不保密□。
(请在以上方框内打“√”)
学位论文作者(需亲笔)签名:
年月日
导师(需亲笔)签名:
年月日
目录
目录I
摘要V
ABSTRACTVII
前言IX
第一章文献综述1
1微生物除草剂1
1.1有除草潜能的微生物类型1
1.1.1真菌1
1.1.2细菌1
1.2按微生物除草剂的有效成分分类2
1.2.1微生物制剂除草剂2
1.2.2微生物源除草剂2
1.3按微生物除草剂的化学结构、类别分类4
2已经商品化的微生物除草剂6
2.1微生物制剂除草剂6
2.1.1Devine6
2.1.2Collego6
2.1.3Dr.Bioseoge7
2.1.4Biomal7
2.1.5Casst7
2.1.6MYX-12007
2.1.7鲁保一号8
2.2微生物源除草剂8
2.2.1茴香霉素与去草酮8
2.2.2双丙氨酰膦与草丁膦8
2.3细菌除草剂9
3微生物除草剂商品化面临的问题9
3.1微生物除草剂的开发程序9
3.2开发微生物除草剂的限制因素10
3.2.1目标杂草的选择10
3.2.2环境因素的影响10
3.2.3菌体生产困难10
3.2.4微生物除草剂与化学除草剂、化学农药的相互影响10
3.2.5制剂问题11
4链格孢菌毒素的研究进展11
4.1链格孢菌毒素的种类12
4.1.1内酯类物质13
4.1.2肽类及其衍生物13
4.1.3二萘嵌苯醌类物质13
4.1.4蒽醌类物质13
4.1.5四氨基酸类衍生物13
4.1.6长链氨基多元醇的丙三羧酸酯类化合物14
4.1.7萜类化合物14
4.2链格孢菌毒素的结构及生物活性14
4.3链格孢菌毒素开发为除草剂的研究18
4.4链格孢菌毒素的生物测定方法19
4.5链格孢菌毒素的分析检测19
4.6关于链格孢菌AAC-毒素除草活性的研究20
第二章HPLC在链格孢菌代谢毒素检测中的应用23
第一节HPLC在链格孢菌毒素提取过程中的应用24
1材料与方法24
1.1材料24
1.2培养基24
1.3链格孢菌的培养24
1.4链格孢菌毒素提取工艺流程(周兵,2007)25
1.5链格孢菌毒素分离工艺流程26
1.6链格孢菌毒素活性检测26
1.6.1链格孢菌粗毒素提取流程中的活性检测26
1.6.2链格孢菌粗毒素分离流程中的活性检测27
1.6.3生测方法27
1.7色谱仪器与试剂27
1.8HPLC定性分析链格孢菌毒素27
1.8.1色谱条件27
1.8.2链格孢菌无菌滤液的HPLC分析27
1.8.3链格孢菌粗毒素提取流程中的HPLC分析28
1.8.4链格孢菌粗毒素分离流程中的HPLC分析28
2结果及分析28
2.1链格孢菌毒素提取过程中的检测结果28
2.1.1链格孢菌粗毒素提取流程中活性检测28
2.1.2链格孢菌粗毒素分离流程中活性检测29
2.2HPLC定性检测流程中的样品30
2.2.1链格孢菌无菌滤液的HPLC分析30
2.2.2链格孢菌粗毒素提取流程中的HPLC分析31
2.2.3链格孢菌粗毒素分离流程中的HPLC分析33
3讨论35
第二节HPLC定量检测链格孢菌培养液中细交链孢菌酮酸36
1材料与方法36
1.1仪器与试剂36
1.2色谱条件37
1.3标准溶液的配制37
1.4样品及其前处理(安传福,2003;周兵,2007)37
2结果与分析37
2.1检测波长的选择:
37
2.2洗脱用量的选择:
38
2.3线性关系的测定38
2.4方法精密度实验39
2.5样品稳定性实验39
2.6加标回收率实验39
2.7样品测定39
3讨论40
第三章链格孢菌代谢毒素除草生物活性的评价43
1材料与方法43
1.1实验材料及供试土壤43
1.2供试药剂44
1.3仪器设备44
1.4助剂对链格孢菌代谢毒素除草生物活性的影响44
1.4.1离体叶片针刺法44
1.4.2温室小杯法45
1.5对杂草幼苗的致病性检测(温室小杯法)46
1.5.1供试杂草46
1.5.2实验及调查方法46
1.5.3供试药剂实验设计47
1.6田间控草试验设计47
1.6.1田间土壤条件47
1.6.2供试杂草及作物47
1.6.3田间试验方法48
1.6.4供试药剂试验设计48
1.6.5田间小区排列方式49
1.6.6调查方法49
1.6.7药效计算方法49
2结果及分析50
2.1助剂筛选结果50
2.1.1离体叶片针刺实验结果50
2.1.2温室小杯实验结果51
2.2离体叶片针刺法生测53
2.2温室小杯实验54
2.3田间实验56
2.4对作物的影响60
3讨论61
全文讨论63
1HPLC在链格孢菌毒素检测中的应用63
2链格孢菌代谢毒素助剂的选择及活性评价63
参考文献65
致谢77
攻读硕士期间发表的论文79
链格孢菌代谢毒素AAC-toxin检测及其除草生物活性的评价
摘要
AAC-toxin是世界恶性杂草紫茎泽兰(EupatoriunadenophorumSpreng)的致病菌链格孢菌NEW菌株产生的毒素,具有多种生物学活性。
本实验室通过多年的研究发现AAC-toxin具有杀草活性,并分离鉴定出AAC-toxin的主要活性成分是细交链孢菌酮酸(TeA)和异细交链孢菌酮酸。
前人已经对AAC-toxin的生产、提取分离工艺、杀草活性系数、杀草谱、杀草机理以及工业化生产关键技术进行了研究。
但是,由于细交链孢菌酮酸结构的特殊性,关于利用HPLC检测该物质的方法并不稳定,细交链孢菌酮酸的除草生物活性还缺乏深入系统的评价。
因此,本文在前人研究的基础上,将HPLC检测应用于链格孢菌培养液和AAC-toxin提取分离工艺流程中的检测;就链格孢菌代谢毒素AAC-toxin除草生物活性通过室内生测和田间试验以及助剂筛选进行系统评价,以期进一步明确AAC-toxin作为生物源除草剂的潜力。
确定了HPLC检测链格孢菌培养液中细交链孢菌酮酸含量的程序。
样品先经大孔树脂和硅胶处理后,用HPLC检测,色谱柱为ODS-C18反相柱,流动相为100%甲醇,流速为0.4mL/min,检测波长为280nm。
选用外标法进行定量。
细交链孢菌酮酸标准品峰面积的自然对数与其相应浓度的自然对数呈良好的线性关系,检测精密度RSD为0.44%,回收率在97%~107%之间,细交链孢菌酮酸的保留时间在6min左右。
检测链格孢菌培养液中细交链孢菌酮酸的平均含量为1.7395μg/mL。
通过离体叶片针刺法和温室小杯法对几种助剂进行筛选,发现氮酮和JFC的复合使用对链格孢菌代谢毒素的除草活性有显著的增效作用。
AAC-toxin的除草生物活性的室内盆钵小杯法和田间生物测定试验结果表明,AAC-toxin对供试马唐、稗草、反枝苋和鳢肠杂草均有良好的抑制或杀除作用,对单子叶杂草活性更好。
回归分析显示,AAC-toxin在4种杂草50%致死浓度上的差距不大;AAC-toxin对4种杂草的90%致死浓度分别为ED901517.612μg/mL、1630.967μg/mL、1737.085μg/mL、4779.174μg/mL。
其中,对马唐的活性最高,而对鳢肠的活性最低。
田间喷施AAC-toxin试验表明,在半个月之内药效会随施药时间延长而增加,施药14d后最高浓度株防效可达97%以上,鲜重防效达98%以上。
施药制剂使用量为4500克/公顷(其中AAC-toxin的有效成分含量为71.1克/公顷)时对杂草的株防效为74.6%~89.1%,鲜重防效为87.1%~97.6%,对作物棉花的伤害率在11.3%~25%。
制剂使用量为4500克/公顷时可以有效控制杂草,对作物安全。
关键字:
AAC-toxin;细交链孢菌酮酸;HPLC;除草活性
DETERMINATIONANDHERBICIDALACTIVITYEVALUATIONOFALTERNARIAALTERNATAAAC-TOXIN
ABSTRACT
AAC-toxinisaphytotoxinproducedbyAlternariaalternata(Fr.)KeisslerisolatedfromCroftonweed(EupatoriunadenophorumSpreng)thatisamalignantweedwithworldwidedistribution,whichexhibitsexcitingvariousbiologicalactivity.Moreover,inourlaboratorypreviousstudieshaveshownthatAAC-toxinhasexcellentherbicidalactivity,themainbioactiveingredientofwhichjustistenuazonicacid.Inearlierinvestigations,thefowllowingworkincludingtheextractioncraftprocedureoftheAAC-toxin,activecoefficientofbioactivity,spectrumofweedcontrol,mechanismofweedcontrolandthekeytechniquesforthecommercializehavebeensystemiccarriedout.However,forthespecificstructureofAAC-toxin,asteadyandripemethodusedtocheckitbyHPLCisstillnotbuiltuptillnow.Furthermore,itisalsonecessarytomakeasystemicandin-depthevaluationonherbicidalactivityofAAC-toxin.Therefore,hereHPLCtestwasusedduringtheextractioncraftprocedureofAAC-toxinforqualitativedetectionoftenuazonicacid,andalsousedtomonitorAAC-toxinproductioninAlternariaalternatacultures.InordertocharifythepotentialofAAC-toxinasabioherbicide,aseriesofexperimentswerecarriedouttoscreensomesuitableadjuvantsforAAC-toxinandevaluateitsherbicidalactivitybythemethodsofbiometricsindoorandfieldefficacy.
WefoundacraftprocedureofextractingandcheckingthecontentoftenuazonicacidinA.alternataculturesinthebasisofHPLCtechnique.Firstly,thefiltratesampleswerepurifiedbymacroporousresinandsilicagelcolumn.ThepurityoftoxinwasdeterminedbyHPLCwiththefollowingsetting:
areverse-phaseC18column,themobilephaseof100%methanol,theflowrateat0.4mL/min,detectionwavelengthat280nm.Secondly,externalstandardwasusedtoquantifytoxincontent.Thereisagoodlinearrelationshipbetweenthelogarithmoftoxinconcentrationandthelogarithmofspectralpeakareainchromatographyofstandardchemical.ForthedetectionoftenuazonicacidinA.alternatacultures,spectralpeakoftoxinoccursapproximatelyatthesixthminute.Moreover,themethodshowshighdetectionprecisionwithaRSDvalueof0.44%,andhighaveragerecoveryrate(>95%).Accordingthismethod,theaveragevalueofconcentrationoftenuazonicacidinA.alternatacultureis1.7395μg/mL.
Afterthescreeningofseveralpesticideadjuvantswereperformedbyacupunctureandpannikinbioassayingreenhouse,it’sfoundthatmixed-useofJFCandLaurocapramcanobviouslyimprovetheherbicidalactivityofAAC-toxin.
Fromexperimentalresultsofpannikinbioassayandfieldtrials,AAC-toxinexhibitsexcellentherbicidalactivityforthecontrolofDigitariasanguinalis(L.)Scop.,Echinochloacrusgalli(L.)Beauv.AmaranthusretroflexusL.andEcliptaprostrata(Linn.)Linn.,especiallymonocotyledonousweeds.Basedonregressionanalysis,theED50valueofAAC-toxinforabovefourkindsofweedsisveryclosed.Whereas,theED90valueissignificantdifferent,whichis1517.612,1630.967,1737.085and4779.174μg/mL,respectively.Obviously,D.sanguinalisisthemostsensitivetoAAC-toxin,andE.prostrataisthemostinsensitiveweedspecieinthefourweedspecies.
ThesprayedexperimentsofAAC-toxininfieldshowedthattheefficacyofweedcontrolwouldincreasewiththeextensionofapplicationinhalfamonth.After14daysofapplicationofAAC-toxin,inthecaseofthehighestconcentrationefficiencyofthewholeplantisupto97%,andfreshweightcontroleffectisover98%.Whenconcentrationoftoxinformulationsusedincottonfieldsis4500g/ha(ofwhichtheAAC-toxincontentoftheactiveingredientis71.1g/ha),controlefficacyofthestemandfreshweightreachto74.6%~89.1%and87.1%~97.6%,respectively.Atthisconcentrationtheinjuryrateofcropcottonalwaysismaintainedat11.3%to25%.So,4500g/haisasuitableconcentrationnotonlytocontroleffectivelyweedsbutalsotoensurecropsafety.
KEYWORDS:
AAC-toxin;tenuazonicacid;HPLC;herbicidalactivity
前言
南京农业大学杂草研究室多年来一直致力于生物和生物源除草剂的研究工作。
强胜(1998)从紫茎泽兰叶病斑上分离鉴定了链格孢菌为紫茎泽兰的自然致病菌,其病斑为棕褐色,周缘不规则;对其分生孢子和菌丝体片段的研究明确了菌丝体培养残液中含有引起紫茎泽兰叶萎蔫的植物毒素;从侵染途径、速度、致病因子等方面明确了菌丝体有强致病能力,且研究了该菌株的培养条件和大批量生产的方法;同时也从环境因素对其致病率的影响进行了探讨;并对其中的5个链格孢菌菌株致病性和若干特征进行了比较(强胜等,2002)。
万佐玺(2000)进一步研究了对紫茎泽兰有致病作用的链格孢菌粗毒素的最佳生测方法,最佳萃取溶剂,初步探索了毒素纯化的方法,对pH值、温度、贮存时间等条件的响应,对紫茎泽兰离体叶片的致病机理及致病毒素的浓度等。
安传福(2003)对该毒素的生产、提取、分离、纯化方法进行了更深入的研究,进一步确定了该毒素的作用浓度,并初步确定了毒素中活性物质的结构为一新的环肽类物质。
环肽是微生物次生代谢产物的一种,环肽类物质以其活性高同时结构相对稳定而倍受关注,已有许多报道表明环肽类物质具有抗菌、抑草活性(Carter等,1984;Matsunaga等,1989;Pedras等,2003),这表明其具有开发为生物源农药的潜力。
周兵(2007)进一步就利用该代谢物开发为微生物源除草剂的工业化若干关键技术开展了深入的研究,以便为其产业化奠定基础。
完善了对紫茎泽兰致病型链格孢菌AAC-毒素的提取工艺,同时也就细交链孢菌酮酸的除草活性、毒理学及其在土壤中的降解动态等方面进行研究,对细交链孢菌酮酸开发为微生物源除草剂的潜力做出进一步评价。
陈世国(2007)研究发现了TeA作用靶标是光系统II的D1蛋白,通过抑制电子传递链,导致过能量化,引起活性氧爆发,杀死杂草。
尽管已经报道用HPLC检测TeA的方法,但是,由于该物质的结构多变,受pH影响较大,实际中检测还十分困难。
AAC-毒素的除草生物活性还缺乏深入系统的评价。
本文是在前期工作基础上,对链格孢菌代谢毒素AAC-toxin做了进一步研究工作,主要有以下两个方面:
1HPLC在链格孢菌毒素检测中的应用研究通过HPLC定性的检测链格孢菌毒素,以确保经过复杂的提取工艺流程后活性成分仍然存在。
并定量检测链格孢菌培养液中活性成分细交链孢菌酮酸的含量。
2链格孢菌代谢毒素助剂的选择及其除草生物活性评价通过对几种常用助剂的生测选择出增效作用最好的助剂,并通过室内小杯生测和田间试验对链格孢菌毒素制剂的活性进行评价,以期为开发利用AAC-毒素作为生物源除草剂奠定基础。
第一章文献综述
1微生物除草剂
微生物除草剂是指利用植物病原微生物或者其代谢产物,使目标杂草感病致死的一种微生物制剂(周燚等,2006)。
常用于微生物除草剂研究的植物病原菌主要有两大类:
细菌和真菌。
被人们选用的病原菌,作为微生物除草剂必需具备以下几个条件:
①这种病原菌可以进行人工繁殖;②这种病原菌在喷施处理后,其生长速度要迅速,否则不能在一定时间内抑制杂草生长直至死亡
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 第一节 HPLC 链格孢菌 毒素 提取 过程 中的 应用