假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范编制说明.docx
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假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范编制说明
《假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范》
征求意见稿
编制说明
一、工作简况
(一)任务来源
根据国家标准委下达的《关于下达2013年第二批国家标准制修订计划的通知》(国标委综合[2013]90号)要求,由中国检验检疫科学研究院、连云港出入境检验检疫局和北京出入境检验检疫局联合承担了该标准的编制工作。
主管部门为农业部,归口单位为全国水产标准化技术委员会。
本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分:
标准的结构和编写》中的要求进行编写的,本标准编号:
20131313-T-424,完成时间为2016年。
(二)修订的必要性
在水生动物RNA病毒的分子生物学检测标准中,一般选择灭活病毒中抽提的RNA作为阳性对照。
此方法具有一定的生物安全风险,且RNA极易降解,无法长久保存。
假病毒技术利用包含MS2噬菌体基因的质粒作为病毒核酸的载体,在大肠杆菌中能将插入的病毒基因转录成RNA,同时表达出MS2噬菌体蛋白包裹病毒RNA,组装成假病毒。
该假病毒不仅含有所需要的RNA片断,而且与MS2噬菌体类似,能够耐受核酸酶的降解,具有较好的稳定性,且不具复制能力和传染能力,可代替灭活病毒作为参考物质用于RNA病毒的分子生物学检测。
目前我国还没有相应的国家标准规范假病毒RNA参考物质的制备和质量控制方法。
针对这一情况,本项目计划建立一套技术标准,包括假病毒的制备方法、质量评价方法和保存条件。
通过该标准可以为RNA病毒分子生物学检测提供稳定安全的RNA参考物质。
该标准的建立将有助于提高我国病原分子生物学检测结果的可靠性。
(三)主要工作过程
1、准备阶段:
本标准完成过程中所使用的质粒为中国检科院动检所自己制备的表达型质粒载体,用于假病毒外膜蛋白的表达。
大肠杆菌感受态来自商业采购,由动检所保存。
同时召集有相关水生动物病毒病诊断经验的科研人员组成工作小组,进行假病毒参考物质制备方法的改进、验证和征求意见稿的起草工作。
2、实验阶段:
2014年全年,由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所牵头,连云港出入境检验检疫局和北京出入境检验检疫局联合实施该标准的实验工作。
3、起草征求意见稿:
2014年12月,根据实验数据,形成《假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范》征求意见稿。
4、征求意见阶段:
5、验证阶段:
2014年11月,起草小组将假病毒样品及标准征求意见稿文本分别发往北京市水产技术推广站、山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心和东北农业大学动物科学技术学院进行验证。
3家实验室验证结果均表明,本标准技术路线合理,所制备的假病毒可以作为阳性参考物质用于水生动物RNA病毒的分子生物学检测。
6、初审意见稿阶段:
7、送审阶段:
8:
审定阶段:
(四)标准主要起草人及主要所做的工作
本标准起草人:
张旻、王娜、吴绍强、景宏丽、邓俊花、周毅、谷强、任彤、江育林。
张旻:
负责确定技术指标,进行假病毒制备条件的优化研究。
王娜:
假病毒质量检测。
吴绍强:
协调各参加单位、技术人员的分工等。
景宏丽:
细胞培养。
邓俊花:
假病毒表达载体的构建。
周毅:
病毒RNA提取。
谷强:
归纳总结实验数据。
任彤:
组织验证工作。
江育林:
标准文稿的审核、征求意见稿相关工作。
二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据
(一)标准编制原则
本标准是按照《中华人民共和国国家标准GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分标准的结构和编写规则》的要求编制的。
编制说明按国家技术监督局“国家标准管理办法”第三章第十六条和《农业部国家(行业)标准的计划编制、制定和审查管理办法》第二章的基本要求而编写。
(二)标准主要内容
由于目前国内外无专门针对假病毒的标准公布,因此本标准的技术内容主要参考国内外发表的假病毒文献,再通过实验验证和改进。
1、适用范围
本标准规定了用于水生动物RNA病毒分子生物学检测的假病毒参考物质的制备和质量控制方法,包括假病毒制备方法、假病毒质量控制方法和保存方法。
本标准适用假病毒类RNA参考物质的制备和质量控制。
2、假病毒参考物质的制备和质量控制方法
(1)制备假病毒的原理
在表达载体多克隆位点中,插入MS2噬菌体的成熟蛋白基因、衣壳蛋白基因和衣壳蛋白基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构。
该重组载体在表达系统中能够将插入的外源片段转录成RNA,同时合成的MS2蛋白能够包裹RNA(含有19bp的发夹结构),自发组装成类似病毒的粒子,成为假病毒(图1)。
图1:
假病毒制备原理示意图
假病毒与MS2噬菌体类似,能够耐受核酸酶的降解,具有较好的稳定性,且不具复制能力和传染能力。
假病毒作为RNA病毒检测的参考物质,应具备以下特征:
(1)包含有病毒RNA,可利用分子生物学方法特异性检测到;
(2)性质稳定,有核酸酶耐受性,病毒RNA不易降解;
(3)不含有病毒cDNA。
(2)制备方法的改进
根据国内外已发表的参考文章,假病毒载体的构建及筛选,按照重组质粒构建和筛选的方法进行即可。
此项技术已经比较成熟,在本编制说明中不再详细论述。
假病毒的表达方法,国内外文献通常使用原核表达法表达假病毒,再使用DNA水解酶去除表达产物中的病毒cDNA。
本实验室通过PCR和RT-PCR检测发现,此种方法制备得假病毒,以未抽提核酸的假病毒溶液作为模板,PCR结果为阴性;而以抽提的假病毒RNA作为模板,PCR结果则为阳性(图2)。
说明该方法只能将溶液中的病毒cDNA去除干净,同时假病毒外膜也包裹了病毒cDNA,其并不受DNA水解酶的影响,导致抽提的假病毒RNA含有病毒cDNA。
这样一来,RT-PCR检测出的阳性结果不能判断是来自于病毒cDNA还是RNA,因此包含病毒cDNA的假病毒不适合作为RNA参考物质。
图2:
PCR和RT_PCR检测原核表达的鲤出血性败血症病毒的假病毒
反应体系和反应条件按照OIE水生动物疾病诊断手册(2014)2.3.8章推荐的方法进行
M:
DL2000 Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1:
未抽提的假病毒溶液作为模板;2:
抽提的假病毒RNA作为模板。
为解决这一问题,确保假病毒的质量,本实验室采用无细胞表达系统制备假病毒。
具体流程为:
将重组质粒DNA转录为mRNA,再使用DNaseI去除转录产物中的DNA。
最后使用无细胞表达系统,表达mRNA编码蛋白,组装成假病毒。
使用该方法制备的假病毒,通过PCR和RT-PCR检测,溶液中和外膜内都不包含病毒cDNA(图3、图4),可确保RT-PCR的阳性结果来源于病毒RNA,使假病毒具备参考物质价值。
图3:
PCR和RT_PCR检测无细胞表达系统表达的传染性造血器官坏死病病毒的假病毒溶液
反应体系和反应条件按照OIE水生动物疾病诊断手册(2014)2.3.4章推荐的方法进行
M:
DL2000 Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1、2:
未抽提的假病毒溶液作为模板。
图4:
PCR和RT_PCR检测无细胞表达系统表达的传染性造血器官坏死病病毒的假病毒RNA
反应体系和反应条件按照OIE水生动物疾病诊断手册(2014)2.3.4章推荐的方法进行
M:
DL2000 Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1、2:
抽提的假病毒RNA作为模板。
同时,也使用荧光定量PCR方法进一步验证,假病毒溶液和外膜中都不含有病毒cDNA(图5)。
图5:
荧光定量PCR检测无细胞表达系统表达的传染性造血器官坏死病病毒的假病毒溶液和RNA中是否包含病毒cDNA。
箭头所指为阳性对照,其余样品都为阴性。
综上所述,本实验改进了假病毒制备技术,使用无细胞表达系统,可制备出无病毒cDNA的假病毒。
(3)标准中主要的质量控制步骤
A.外源基因的引物设计原则;
B.外源基因扩增体系;
C.凝胶回收的外源基因的质量检测;
D.将假病毒重组质粒切为线性DNA的内切酶的选择标准;
E.线性化假病毒重组质粒的鉴定;
F.转录体系与反应条件;
G.DNaseI(RNasefree)去除mRNA中的DNA;
H.转录的mRNA的质量检测;
I.无细胞表达体系与反应条件;
J.假病毒的质量检测。
3、假病毒RNA参考物质的质量判定
分别使用PCR和RT-PCR方法对假病毒的质量进行判定:
在阴性对照和阳性对照都成立的情况下:
若未抽提的假病毒溶液PCR产物为阳性,则表明溶液中有病毒来源的DNA杂质,则假病毒不能作为RNA参考物质使用,必须重新消化以去除DNA;
若假病毒RNART-PCR产物为阴性,则表明假病毒未包裹病毒RNA,或假病毒提纯失败,必须重新制备假病毒。
若未抽提的假病毒溶液和假病毒RNA的PCR结果都为阴性,假病毒RNART-PCR结果为阳性。
则假病毒质量合格,可以作为RNA参考物质,用于RNA病毒的分子生物学检测。
三、主要试验或验证的分析、综述报告,技术经济论证,预期的经济效果
(一)主要验证的分析。
委托北京市水产技术推广站、山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心和东北农业大学动物科学技术学院对征求意见稿的主要技术内容进行验证。
1、测试材料
传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)假病毒溶液由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所提供;PCR试剂和RT-PCR试剂、以及核酸提取、核酸电泳试剂等由测试单位提供,引物由测试单位按OIE《水生动物疾病诊断手册》(2014)第2.3.4章提供的序列合成。
2、验证方法
先提取假病毒RNA。
按照OIE《水生动物疾病诊断手册》(2014)第2.3.4章推荐的方法,分别以未抽提的假病毒溶液,和提取的假病毒RNA为模板,进行PCR和RT-PCR检测。
3、验证结果
(1)北京市水产技术推广站:
图6:
PCR电泳结果
M:
DL2000Marker;CON:
阴性对照;P:
阳性对照;1:
未提取的IHNV假病毒溶液;2:
提取的IHNV假病毒RNA
图7:
RT-PCR电泳结果
M:
DL2000Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1-4:
IHNV病毒液提取的RNA;5、6:
未提取的IHNV假病毒溶液;7:
提取的IHNV假病毒RNA
(2)山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心:
图8:
PCR电泳结果
M:
DL2000Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1:
未提取的IHNV假病毒溶液;2:
提取的IHNV假病毒RNA
图9:
RT-PCR电泳结果
M:
DL2000Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1:
未提取的IHNV假病毒溶液;2、3:
提取的IHNV假病毒RNA
(3)东北农业大学动物科学技术学院:
图10:
PCR电泳结果
M:
DL2000Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1:
未提取的IHNV假病毒溶液;2:
提取的IHNV假病毒RNA
图11:
RT-PCR电泳结果
M:
DL2000Marker;N:
阴性对照;P:
阳性对照;1:
未提取的IHNV假病毒溶液;2:
提取的IHNV假病毒RNA
4、结论
根据《假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范》征求意见稿中阐述的方法制备的IHNV假病毒,可以作为参考RNA用于IHNV的RT-PCR检测。
(二)技术经济论证
根据本标准中阐述的制备方法和质量控制方法制备的假病毒,可作为阳性参考RNA用于水生动物RNA病毒的分子生物学检测,为有相关诊断和防控任务的实验室提供技术支撑和物质保障。
(三)预期的经济效果
我国是水产品养殖大国和进出口大国,面临国内外水产病害的威胁。
本标准适用于制备水生动物RNA病毒的阳性参考RNA,有利于提高我国水生动物疫病病原检测结果的可靠性,因此本标准的制定和推广偏重于社会效益。
四、采用国际标准和国外先进标准程度与国际、国内同类标准水平对比情况,或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况
目前国内外无专门针对假病毒的标准公布。
国内外RNA病毒分子生物学检测标准中使用得阳性对照,主要为从宿主发病组织或标准毒株中提取的总RNA。
从安全性考虑通常不允许直接把活病原作为参考物质提供给使用单位。
我国的相关法规如《动物病原微生物菌(毒)种保藏管理办法》(农业部2008年第16号令)也对此提出了严格的限制。
而且RNA极易降解。
因此,假病毒作为稳定的、无生物安全隐患的参考物质,可以代替病毒提供给病原检测部门。
五、与现行的法律、法规和强制性国家标准的关系
本标准与现行法律法规和强制性国家标准无冲突。
六、重大分歧意见的处理经过和依据
无重大分歧意见。
七、标准性质(强制性,推荐性)的建议,特别是对建议批为强制性标准的理由应充分说明
目前国内外无专门针对假病毒的标准公布,而RNA病毒的分子生物学检测需要制备相应的阳性参考样品,因此建议将该标准性质确定为推荐性标准,检测实验室可根据本单位检测任务选择制备何种病毒的阳性参考RNA。
八、贯彻标准的要求和建议措施(组织实施、技术措施、过渡办法等)
建议相关水产管理、疫病防控部门通过开展标准宣传贯彻会、技术培训班等方式推广本标准。
九、废止现行有关标准的建议;
无。
十、其他应予说明的事项。
无。
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- 关 键 词:
- 病毒 作为 RNA 参考 物质 制备 质量 控制 规范 编制 说明