03细胞和细胞器及间质的分离.docx
- 文档编号:1661120
- 上传时间:2023-05-01
- 格式:DOCX
- 页数:24
- 大小:35KB
03细胞和细胞器及间质的分离.docx
《03细胞和细胞器及间质的分离.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《03细胞和细胞器及间质的分离.docx(24页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
03细胞和细胞器及间质的分离
第三章细胞和细胞器及间质的分离
细胞内各种结构的比重、大小不同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,所以常用不同介质、不同转速、不同时间,通过分级离心,将细胞内各种结构组分(细胞核、核仁、线立体、高尔基复合体、溶酶体、染色体等)分离出来。
主要方法是:
组织匀浆的制备、离心分级分离各组分、分析鉴定三个步骤。
一、细胞的分离
根据细胞的大小、密度常可分离不同具有不同生物学特征的各种细胞亚群。
其原理是处于悬液中的细胞沉降率与细胞的直径成比例,也与细胞密度和分离介质密度之间差异成比例,假设细胞为球形,则其在溶液中在引力场内的沉降速度以下列公式表示V=2g(ρc–ρs)r²
9η
遵循Stokes定律,其中:
ρc和ρs分别是细胞和溶液的密度,η为溶液粘度,r为细胞半径,g为重力加速度。
根据细胞直径(大小)的分离方法:
主要是速度下降。
细胞在单位引力下,通过低密度介质,或在低离心力作用下,通过密度梯度沉降。
由于细胞大小不同,沉降速度不同,细胞越大沉降越快。
根据细胞密度分离是等密度分离,就是细胞在连续密度梯度分离介质中,在强离心作用下,细胞最后到达与其自身密度相同的分离介质层面,并能保持平衡,在非连续密度梯度中,分离的细胞主要集中于介乎其自身密度两种密度介质的交界面上,从而达到分离。
操作方法:
(一)单位重力沉降法:
分离介质主要是牛血清白蛋白,其分离的细胞活性高、费用也昂贵。
现已用蔗糖替代,
仍能取得较好的分离效果。
1.在固定沉降池上方加入30mlPBS/BSA,含有细胞1×108于池底。
2.从池周边加入50mlPBS覆盖于样品上,不要使整个界面破坏。
3.下口接1%蔗糖梯度液,稍松下口,缓慢放入50ml1%蔗糖梯度液,约10ml/min。
4.接通梯度混合仪,从下口加入1200ml1~2%蔗糖梯度液,速度为50ml/min。
5.最后加入500ml2.5%蔗糖梯度液。
6.整个沉降系统,于4℃,静置4h,这时细胞按大小先后沉降,未成熟的红细胞在
先,成熟的网织红细胞在最后。
7.用自动收集器每15ml收一组分,流速15ml/min。
8.收集的细胞经过PBS清洗,300g×10min离心2次,以去除蔗糖。
9.Giemsa染色,确定各期细胞所在组分。
(二)等密度梯度离心法:
1.Ficoll-Hypaque分离细胞:
直接用Ficoll作分离介质,粘度大,效果不明显,加入Hypaque可降低分离粘度,提高分离效果。
(1)制备分离液Ⅰ(比重1.077g/ml):
取10份;33.9%Hypaque,24份;9%Ficoll混匀。
(2)制备分离液Ⅱ(比重1.119g/ml):
取10份;50%Hypaque,20份;9%Ficoll混匀。
(3)制梯度用硅化的15ml玻璃管,底部加入4ml分离液Ⅱ,然后用注射器在其上小心加入4ml分离液Ⅰ。
不要破坏梯度界面。
(4)加入2ml血清样品于梯度顶部,不要破坏梯度界面。
(5)800g×20min,25℃,平甩离心。
(6)离心后可见:
最上层是血浆和血小板;血浆与分离液Ⅰ界面是淋巴细胞(90%)和单核细胞;Ⅰ液与Ⅱ液界面是多形核细胞;沉底的是红细胞。
2.Percoll分离细胞:
Percoll是一种外面包裹着PVP的硅胶颗粒,对细胞无吸附作用,产生的渗透压非常小,因此在全部密度范围保持等张。
可在较短的离心速度下,短时间达到浮力密度平衡,对细胞无毒性、无副作用,易于从细胞表面洗脱。
(1)分离骨髓细胞:
①配制100%Percoll:
取20mlPercoll原液,加1.5ml×10PBS、0.2mlCa/Mg液。
用0.01mol/LHCL调pH至7.2,用NaCl或水调渗透压至295~310mosmol/L。
②用PBS配制:
40%Percoll、70%Percoll、80%percoll。
③按比重大小,每一浓度取10ml通过注射器加入50ml离心管三层,两个界面。
④将1×108细胞的2ml骨髓细胞悬浮液小心加于梯度顶部。
⑤3,000g×30min,18~20℃,平甩离心。
⑥用平滑头吸管,小心均匀的吸出所需细胞,在40%与70%介质界面,主要是幼稚细
胞。
⑦用20倍体积PBS洗涤细胞,300g×15min离心,收集细胞。
(2)分离血细胞:
①5ml60%Percoll,5ml全血,250g×10min,室温平甩离心,上层为血浆和血小板,Percoll顶部为淋巴细胞,底部为白细胞和红细胞。
②4ml80%Percoll,4ml60%Percoll,4ml全血,350g×20min,室温平甩离心,80%~60%Percoll界面为粒细胞,底部则是红细胞。
二、细胞核的分离
细胞核作为一个功能单位,完整地保留细胞物质,并指导RNA合成,后者为蛋白质其它细胞组分合成所必需。
因此,细胞的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。
不同组织来源的细胞经匀浆后,用分级离心或声波处理等方法进行分离纯化。
操作方法:
1.制备巨噬细胞:
取体重约200g大鼠一只,腹腔注射0.2%配制的1%巯基乙酸钾5~6ml两次,5天后处死。
冰浴中用生理盐水收集腹腔细胞,生理盐水洗涤细胞、1500r/min×5min离心收集细胞,沉淀80~90%为巨噬细胞。
2.将细胞悬液在5倍体积的10mmol/LTris-HClpH7.4,10mmol/LNaCl,1.5mmol/LMgCl2中,加入10ul10%SDS/ml,用玻璃匀浆器轻轻地匀浆。
3.加入2ml0.34mol/L蔗糖,10mmol/LMgCl2再匀浆1次,下面铺一层0.88mol/L蔗糖。
800g×5min离心,收集沉淀的细胞核。
4.在0.88mol/L蔗糖中再纯化一次,然后将细胞悬浮在10ml0.34mol/L蔗糖,0.05mmol/LMgCl2。
用声波处理5~6次,每次10s。
5.加2倍体积0.88mol/L蔗糖,8oog×30min离心,沉淀部分为细胞核。
6.将细胞核悬浮在2.4mol/L蔗糖中,50,000g×1h离心,沉淀为纯细胞核,将其保存在0.25mol/L蔗糖、0.55mmol/LMgCl2中备用。
三、膜蛋白质的分离
在生物膜(biologicalmembrane)双脂层的结构中,镶嵌着不同类型的蛋白质分子,统称为膜蛋白质。
它执行着不同的功能,并构成细胞骨架(cytoskeleton),其分子量分布在1万至24万。
生物膜的主要化学成分是脂类和蛋白质,此外还有糖类,它是以糖蛋白和糖脂的形式存在,生物膜不仅是细胞间的分隔物质和构成细胞的骨架,而且它与机体和细胞内的许多主要功能有关,如物质运输、信息交换、能量的传递、吸收作用和分泌作用以及兴奋的传导等,都与生物膜的结构有关。
膜结构的完整性与正常机能的进行是密切相关的,而其中,膜结构上各类蛋白质又具有更重要的功能。
当膜结构发生异常会导致功能的障碍和疾病的发生。
因此,对生物膜的研究愈来愈受到各门类学科的重视。
对膜蛋白质的分离和组分的研究,现阶段以红细胞膜最多,Dodge等首先以低渗和高速离心法可去除血红蛋白和细胞内含物,而获得较纯净的血细胞膜,又称为血影(ghost),后来Fairbanks等又利用聚丙烯酰胺凝胶(polyacryamidegel)电泳方法对其蛋白质组分进行分离。
经研究发现,细胞膜上有两类蛋白质,一类蛋白质结合的不够紧密,经改变离子浓度或加入熬合剂(chllatingagent),即可与膜分离,且溶于水,现在把这类蛋白质通称为边周蛋白(peripheralproteins)或表面蛋白(extinsicproteins),另一类蛋白质膜上的这类结合的较紧密,贯穿于膜的两侧,需经去垢剂、胆碱或有机溶剂处理后,才能从膜上分离出来,如果分离方法不当,容易使分子结构发生改变,其生物活性和功能也受到破坏。
它及不溶于水溶液,这类蛋白质称之为内在蛋白(intrinsicproteins)或插入蛋白(integralproteins)。
膜中的蛋白质与脂类分子相结合,维持了细胞的完整性。
现在对膜蛋白质的研究还很不完全,但一致认为膜上所有的蛋白质都是在一定的脂类环境中执行着一定的功能,有的是酶分子,有的是输送物质进出细胞的载体或泵,有的属于受体,有人已成功地把从细胞膜分离出来的蛋白质分子又重新组装到人工膜中,而仍保持其蛋白质的活性。
已经发现,很多蛋白质与糖结合形成糖蛋白,有人认为糖蛋白与稳定膜蛋白质的分子活性有关,也有人认为可使细胞膜的流动性增加,利用PAS的染色反应可显示出糖蛋白的存在。
操作方法:
(一)血影膜制备方法
实验步骤见图
1.5ml全血,加入1~2倍的PBS,1,000r×5min,4℃,离心。
2.弃上清及中间层,留下层的压积的红细胞(packedRBC)。
3.重复以上1~2次,洗涤被压积的红细胞。
4.弃上清,留沉淀,即为浓缩的RBC。
5.加入15~20倍的pH7.6的PBS,混匀,常温下,静置20~25min,低渗,
10,000~15,000r/min×15~20min,4℃,离心。
6.弃上清(PBS和血红蛋白)、弃下层的粉红色扭状块(含大量蛋白酶),要清除干净,
否则会影响电泳结果,留中间的血影膜层。
7.将团块状的沉淀,重复6步,洗涤1~2次,直至血影膜呈乳白色,弃上清液,沉淀
即为所制备的样品。
(二)样品的电泳分离
1.制板
采用原盘或平板电泳,将5.6%胶用注射器注入电泳管或平板腔内,使胶液高度为110mm
左右,如发现胶液内留有气泡,应及时用长针头注射器清除,胶厚约为15~20mim,用注射器在胶液表面轻轻加入蒸馏水或电泳缓冲液,以防凝胶表面干结和氧化,在室温下放置4~5h或过夜,以进行固化处理。
2.溶解样品
(1)按一份血影膜加入一份溶解液混匀。
(2)按总体加入DTT(final40mol/L,约12.3mg/ml)。
(3)在90~100℃水浴中溶解3min,用自来水冷却至室温。
(4)加2~3滴考马斯亮蓝R-250混匀待用。
3.电泳
固化处理完成后,除去凝胶表面的水或电泳缓冲液,并除去底部的纸封或其它隔离物,
然后分别向电泳管顶端或平板样品孔内加入50~100ul溶解的样品,并在其上面加入电泳缓冲液。
按常规凝胶电泳方法加入电泳缓冲液,并接通电源,如系原盘电泳,开始5min内每管
1mA,5min后,每管3~5mA,如系平板电泳,开始5min内,每管1.5mA,之后,每管4~6mA。
电源时间视指示剂(TD)移动情况而定,最快需2~3h,有时需5~6h。
在电源开始之前,应及时清除凝胶上下端存留的气泡。
在电泳过程中,所用时间可根据指示剂,考马斯亮篮R-250所走的部位而定,当指示剂走向下端约1~1.5cm处,即可停止电泳。
4.剥胶
如用圆柱电泳,可用长针头大号注射器吸满水,在靠电泳管的内壁插至1/3处,向里注
水并不断旋转电泳管,使其注射针头始终沿着电泳管的内壁与凝胶之间转动,切勿将针头直接插入凝胶内,以防止胶柱断裂。
用0.04%考马斯亮篮R-250染液,复染3~4h或过夜。
5.脱色
其时间视脱色情况而定,待分带清晰,无带分布处基本透明时,即可停止。
(三)对血影蛋白成分的分析
按SDS聚丙烯凝胶电泳的位置,以移动距离的顺序,各条染色带命为bang1、2、3……
7(图2),在血影蛋白电泳扫描图中,图3是分离的膜蛋白各带峰的分布,其中H为剩余的血红蛋白,TD(trackingdye)是低分子示踪染料,图3下是PAS(periodicacidschiff)染色带扫描图,这种schiff过碘酸试剂对糖类染色具有专一性,因此可显示出糖蛋白的存在,这些糖蛋白统称为血型糖蛋白(glycophorin),其中PAS1,PAS2是主要染色带,二者又称glycophorinA,PAS3、PAS4也是糖蛋白,但含量极少。
四、层粘连蛋白的分离
层粘连蛋白(Laminin,LN)是一种主要存在于上皮细胞外基质中的大分子非胶原性糖蛋白(分子量约为20~40万)。
其功能与FN相似,影响着胚胎细胞的发育和胚胎团块的形成。
现已发现LN与神经细胞的运动、分化及肿瘤的转移关系密切。
许多研究都表明LN是机体中一种重要的糖蛋白组分。
因此,分离提纯LN将为我们深入地研究细胞外环境与细胞运动、增殖、分化之间的关系,研究肿瘤转移的机制提供方便。
基于LN主要存在于基膜中,我们选择含有大量的EHS小鼠肉瘤为材料,用一定浓度0.5mol/LNaCl及脱氧胆酸钠进行抽提基膜中的LN等,用高盐(1.7mol/LNaCl)除去其中的杂质胶原。
最后通过SephacrylS-300分子筛层析柱,便可制得纯化的LN。
操作方法:
1.取裸鼠体内传代的EHS瘤10g,剪碎并匀浆。
2.用(Tris-HClpH7.6,1%脱氧胆酸钠,0.5%PMSF,0.5%细球菌核酸酶)溶液,4℃搅拌抽提20min。
3.1,000g×10min,4℃,离心,弃上清。
4.沉淀用Tris-HClpH7.6,1%脱氧胆酸钠、0.5%PMSF溶液洗涤2次,1,000g×10min,4℃,离心,弃上清。
5.沉淀用Tris-HClpH7.6,0.5%PMSF溶液洗涤2次,1,000g×10min,4℃,离心,弃上清。
6.沉淀再用Tris-HClpH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/LNaCl溶液,4℃搅拌抽提过夜。
7.1,000g×20min,4℃,离心,弃沉淀。
8.上清中慢慢加入固体NaCl,至终浓度1.7mol/L,其间不断搅动溶液。
冰浴置4h。
9.10,000g×20min,4℃,离心,弃沉淀(胶原)。
10.上清用超薄滤膜浓缩或将其袋入透析袋,在袋外放一些PEG6000来进行浓缩至体积为5ml。
11.上样品到已经用Tris-HClpH7.6、0.5%PMSF、0.5mol/LNaCl溶液平衡了的SephacrylS-300层析柱上(平衡柱需4倍柱体积的平衡液),并用同一溶液洗脱。
收集留出的第一峰,即电泳纯LN。
12.产率计算应用考马斯亮蓝G-250测蛋白浓度法,以BSA为标准,测定595nm处的光吸收,计算LN的含量。
一般产率为0.5~1ugLN/g瘤。
13.存储浓缩LN(1mg/ml),分装后-70℃保存。
五、弹性蛋白的分离
弹性蛋白的溶解性极差,一般采取的技术路线是使用多种手段将非弹性蛋白去除,以获得不溶性的弹性蛋白。
操作方法:
1.将富含弹性蛋白的组织(如器官、胸膜、主动脉等)上附着的结缔组织仔细去除。
2.用打碎机将组织在4℃、50%吡啶水溶液中打碎,3,000g×10min离心,弃上清,取
沉淀。
3.沉淀用冷蒸馏水离心洗涤,直至细胞无吡啶气味为止。
4.真空干燥后,浸入液氮中,稍后取出研磨成粉,将其悬浮于2mol/LCaCl2溶液中,
4℃持续搅拌24h。
5.离心弃上清,沉淀用冷蒸馏水离心洗涤,无水乙醇作用20min,2#砂芯漏斗滤去
抽提液,沉淀2:
1(V/V)氯仿-甲醇浸泡20min,再经2#砂芯漏斗滤去抽提液。
沉淀用乙醚冲洗后,冷冻干燥。
6.冷冻干燥后的沉淀,用胶原酶消化液悬浮,加入纯化的胶原酶(组织:
酶=50:
1W/W),
37℃,消化过夜。
7.离心弃上清,沉淀重复6、7步骤,离心得到的沉淀用冷蒸馏水洗涤。
8.将沉淀移入具塞玻璃烧瓶,加入含有5mol/L盐酸胍、0.05mol/L二硫赤藓糖醇、
2.6mmol/LEDTA的0.1mol/LTris缓冲液(pH8.5)中,通氮气,加塞,37℃过夜。
离心弃上清,沉淀用蒸馏水洗涤2次。
9.将沉淀再移入具塞玻璃烧瓶中,加入含有6mol/L尿素,34.7mmol/LSDS及含有
0.05mol/LTris缓冲液(pH7.7)中,通氮,加塞,室温过夜,离心,弃上清。
10.重复9步,2次。
离心取沉淀,蒸馏水透析至检测不到SDS为止。
沉淀冷冻干燥得弹性蛋白制品。
六、胶原蛋白的分离
胶原蛋白是细胞外间质的主要成分,占人体总蛋白的1/3胶原蛋白具有广泛的生物活性,参与细胞增殖、运动、分化、以及肿瘤细胞的转移等病理过程。
胶原提取物可作为某些特殊细胞培养的基质,模拟细胞的体内环境。
胶原可以作为整形及美容的填充物材料,也可用于人造血管的预凝,在许多疾病的诊断与研究(肝硬化、肺纤维化、硬皮病等)中,胶原的提取及分析已成为必要的手段。
目前已发现的胶原类型有13种,结构与功能较清楚的有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原。
不同类型胶原在体内的分布不同。
Ⅰ型胶原主要分布在筋腱、骨骼、牙齿和各种软组织器官中;Ⅱ型胶原主要在透明软骨和弹性软骨中;Ⅲ型胶原在各种软组织脏器内;与Ⅰ型胶原分布大致相同;Ⅳ型胶原在基膜里;Ⅴ型胶原在细胞外周。
常用的胶原提取法为胃蛋白酶限制性降解法。
在0.5mol/L乙酸中加入一定量的骨蛋白酶,于4℃作用于粉碎的组织,可将组织中的胶原蛋白提取出来,提取出的胶原,可按各型胶原析出的盐浓度不同而彼此分离。
各种蛋白在酸性或中性的条件下被盐析沉淀所需的氯化钠的浓度。
操作方法:
所有操作需在0~4℃下进行。
1.取皮肤小心刮去毛发,剔去皮下脂肪及结缔组织。
2.丙酮中浸泡过夜,进一步去除残留脂肪,用冷蒸馏水清洗,除去丙酮。
3.将组织切碎,倒入少量0.5mol/L乙酸(pH2.5),用打碎机打制成匀浆,加入胃蛋白
酶。
酶量与湿组织量之比为1:
100,再加入足量0.5mol/L乙酸,使溶液中酶的终浓度为2mg/ml。
搅拌过夜。
16,000r×45min离心,弃沉淀。
4.留上清。
沉淀重复3步,弃去沉淀。
将2次上清合并。
5.上清边搅拌边缓缓加入氯化钠粉末,使终浓度至0.7mol/L,放置过夜。
16,000r×
45min离心,弃上清。
6.沉淀用匀浆器匀浆,加0.5mol/L乙酸溶液,使溶液完全透明。
7.边搅拌边缓慢加入氯化钠,使终浓度为0.7mol/L,放置过夜。
8.16,000r×45min离心,弃上清。
沉淀冷冻干燥,即得皮肤胶原制品。
七、线立体的分离
线立体是细胞呼吸的主要场所,细胞活动所需的能量主要由在线立体内进行的氧化所产生的能量来供给,建立线立体的关键要保持其完整性及纯度。
分离的原则可用分级离心方法,低速去除细胞核及细胞碎片后,再用高速梯度离心分离线立体。
操作方法:
所有操作需在4℃下进行。
1.将饥饿一天的300g雄性大鼠处死迅速取出组织,浸在缓冲液A中(250mM甘露醇,
0.5mmol/LEGTA,5mmol/LHepes,0.1%(W/V)BSA,pH7.4),剪碎。
2.600g×5min离心,2次,去除细胞核及碎片。
3.上清在10,300g×10min离心,沉淀部分为线立体粗制品部分。
4.将沉淀部分悬浮于5ml缓冲液A中。
5.分装4个含有20ml,30%V/VPercoll(用225mmol/L甘露糖醇,1mmol/LEGTA,
25mmol/LHepes),0.1%(W/V)BSA,(pH7.4)离心管中,95,000g×30min离心。
6.收集密度底层的褐黄色线立体部分。
7.6,300g×10min,缓冲液A离心洗涤2次。
8.沉淀加适量缓冲液A于-70℃保存。
八、溶酶体的分离
溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器,含有高浓度的各种水解酶类,用于细胞内的消化过程。
它被一层单位膜单独包围,含有12种以上的酶,其中包括蛋白酶、核酸降解酶和糖苷酶。
它们都是消化酶,能分解细胞内的物质,如蛋白质、核酸、多糖类。
这种消化酶与细胞内含物的其它部分严格的分开,否则它们将进行自身消化,因此又有“自杀袋”自称。
现在认为溶酶体与卵的受精、形态发生、衰老及某些疾病有关,其分离纯化方法可用分级离心,再用等密度蔗糖梯度离心纯化,也可用Triton-WR1339处理大鼠,2~4h后杀死,毒性低,比重小的Triton-WR1339集中在溶酶体上,使溶酶体比重便轻,易于分离。
操作方法:
所有操作需在4℃下进行。
1.制备蔗糖梯度溶液:
取带有两个连同小杯的梯度混合器,两个小杯分别装入117ml
2.1mol/L蔗糖和13ml1.1mol/L的蔗糖。
2.将大鼠处死取出肾脏,以1:
8(重量/体积)比例加入0.3mol/L蔗糖,然后在玻璃匀
浆器中匀浆肾脏组织。
3.以150g×10min离心,弃沉淀,取上清液9,000g×3min离心,弃上清液,取沉淀。
4.沉淀从上至下依次为白色、黄褐色、暗褐色三种不同颜色层,上层为膜成分的混合
物,中层为线立体部分,最底层则为半纯化的溶酶体。
先用吸管小心吸掉上层,然后沿管壁加入几毫升0.3mol/L蔗糖,慢慢摇管使界面层悬浮起来弃之。
用0.3mol/L蔗糖洗涤1次,底层溶酶体部分悬浮在2.5ml0.3mol/L蔗糖中。
5.将2ml悬浮的半纯化的溶酶体铺在蔗糖梯度上面,用玻璃棒搅动最上层的梯度,使梯度和溶酶体之间的界面破坏,然后100,000g×150min离心,离心结果可见:
梯度溶液分3条明显的带和较少的沉淀。
最下层的暗黄色到褐色的带即为纯化的溶酶体。
九、微粒体的分离
微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡,含核糖核酸、蛋白质和脂类。
蛋白质中包括多种与糖类、脂类和蛋白质代谢有关的酶。
通过甲基化或氢化作用,使药物修饰而解毒的酶也在微粒体内将。
RNA存在于微粒体的小颗粒即核蛋白体中,分离微粒体的方法是利用分级离心方法,去掉细胞核、线立体后,经超速离心法而制备。
操作方法:
1.将体重约为300g饥俄20h后的大鼠断头,取出肝脏,洗涤,剪碎,加2倍体积
的介质(含0.15mol/L蔗糖,0.025mol/LKCl,0.1mol/LTris-HClpH7.4,0.005mol/LMgCl2)溶液,在玻璃匀浆器中匀浆。
2.15,000g×10min离心,弃沉淀,取上清。
3.100,000g×60min离心,弃上清,取沉淀。
4.10,000g×20min离心,沉淀即为微立体。
5.将微立体保存在介质溶液中。
十、细胞及亚细胞组分的分离
细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成,细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架等,这些也称为亚细胞组分。
对于细胞的结构及功能的研究,是细胞生物学的基本课题,其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分。
这种拆离的方法,使细胞中各种生物学过程彼此分开,互不干扰,便于确定一种复杂过程中的细节,从而深化我们对细胞整体功能的认识。
用这种方法已经阐明了细胞中的许多重要反应,例如蛋白质的合成机制,最初发现细胞质粗提液使RNA翻译出蛋白质,将细胞质提取液分部分离,依次得到核糖体、tRNA和各种酶,用分别加入或不加入这些纯组分的方法,证实所有这些分子构成了蛋白质合成体系,以后用同样的体系阐明了遗传密码。
分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。
差速离心适于分离密度和大小显著数量级差别的颗粒,用在分离细胞器是成功的,也是最常用的。
对于精细部分的分离,则密度梯度离心效果更好,但制备介质梯度比较费时。
然而,针对不同的材料和分离目的不同,采用的分离介质及方法也有所不同。
操作方法:
(一)制备大鼠肝细胞匀浆
实验前大鼠空腹12h,取肝脏,迅速用生理盐水洗净血水,用滤纸吸干。
称取组织2g,
剪碎,用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。
然后按每克肝9ml冷的0.25mol/L蔗糖溶液(分数
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 03 细胞 细胞器 间质 分离