课题Kit无义突变致W3Bao小鼠生殖腺异常及纯合子贫血死亡Word格式.docx
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GonadialAbnormalityandHomozygousDeceasefromtheNonsenseMutationofKitinW-3BaoMouse
WUPei-lin1,YINHong-ping1,YINLi-jing2,ZHUJie2,ZENGYong-mei2,LIUGui-jie1,
KANGXiao-dong1,YULi-ping1,GUMei-er1,YUANHong1,WUBao-jin1,2,*
(1.LaboratoryofExperimentalAnimalScience,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310036;
2.ComparativeMedicineCenterofYangzhouUniversity,Yangzhou225009)
Abstract:
TheW-3Baomouse,whichwasobtainedinpreviousENUmutagenesisproject,isanewmutantcausedbythenonsensemutationofKitgene.MatingandgrossobservingcombiningwithPCRandsequencingwereusedfordeterminingthegenotypesoftheW-3Baomice.Embryonicdevelopment,hematologicaldetectionandhistopathologicsectionmethodswereusedfortheirphenotypeanalysis.TheresultsshowedthattheW-3Bao/+mousewaswhitebelly,whitelimbterminalsandwhitetailtip.However,therewasnodifferenceoftheexternalappearanceamongtheW-3Bao/+,W-3Bao/3Baoandwildtypemicefortheembryoof12.5days.TheW-3Bao/3Baoembryoslookedpalesincepregnant14.5daysanddwarfsincepregnant16.5days.TheextremelylowlevelofhaematochromeandbigredbloodcellsofW-3Bao/3Bao18.5-day-embryoswerefoundintheinspectionsofbloodroutineitemsandbloodsmear,whichresultedindeathofW-3Bao/3Baohomozygousmousearoundbeingborn,andnolivepostnatalW-3Bao/3Baomousewasfoundinthisstudy.NospermatogoniumatdifferentdevelopmentalstageswasfoundinsomecontortedseminiferoustubulesinadultW-3Bao/+mouse.Attheageof18.5-dayembryo,thespermatogoniumofW-3Bao/3Baomiceonlyliedininterstitialtissueandnooneliedincontortedseminiferoustubules,whilethespermatogoniumofW-3Bao/+orW+/+miceliedininterstitialtissueandincontortedseminiferoustubulesinthesametime.Attheageof18.5-dayembryo,cellsarrangedirregularlyandprimordialfollicleswerenotseenintheW-3Bao/3Baoovaries,whileprimordialfolliclesappearedclearlyintheovariesofW-3Bao/+orW+/+mice.WeconcludedthatbecauseofthenonsensemutationofKitgene,theW-3Bao/+miceshowwhitespotandabnormaldevelopmentofsomecontortedseminiferoustubules.TheW-3Bao/3Baomicediearoundbirthresultingfromseveremacrocyticanemiaandshowabnormalgenitalglandsofbothgenders.
Keywords:
W-3Baomouse;
Kitgene;
Decease;
Macrocyticanemia;
Gonadialabnormality
功能基因研究的策略之一是获得某一基因的众多突变体,通过对该基因突变群体内表现型及基因型的比较分析,推导出特定基因的生物学作用(Balling,2001;
Fu,2003)。
Kit是一个著名的与发育相关的基因,其编码的蛋白质是位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体,控制着血细胞、黑色素细胞、原始生殖细胞、听毛细胞、肥大细胞以及小肠Cajal细胞等的发育(Geissleretal,1988;
Chabotetal,1988;
Cableetal,1994;
Huizingaetal,1995;
Broudy,1997;
Rajaramanetal,2003;
Magnoletal,2007)。
至2008年10月,小鼠(Musmusculus)基因组数据库(MouseGenomicInformatics,MGI)中已经收录97种不同的Kit突变体,这些众多的Kit突变系小鼠对Kit的功能研究发挥了重要作用。
W-3Bao是本研究组通过ENU(乙酰基亚硝基脲)诱变获得的呈单基因显性遗传的白斑突变系小鼠;
通过连锁分析法,以微卫星为标记把白斑突变基因定位于第5号染色体距着丝粒41.57—42.91cM之间(Wuetal,2003),确定Kit为白斑候选基因;
在此基础上,已经鉴定出W-3BaoKit基因编码区第441碱基T颠换为A,使得第147位密码子由UAU变为终止密码子UAA,这一无义突变导致Kit编码蛋白提前终止(Xueetal,2007)。
根据国际通用命名规则,该小鼠被命名为W-3Bao,收录在MGI数据库中(http:
//www.informatics.jax.org/javawi2/servlet/WIFetch?
page=alleleDetail&
key=27699)。
尽管有关W-3Bao小鼠的研究工作已经不少,但是一直未能获得突变基因纯合子小鼠,更不知道纯合子小鼠的表型特征。
本文以W-3Bao小鼠为研究对象,研究其表型特征以及胚胎发育过程,发现突变杂合子小鼠部分精曲小管发育异常,纯合子小鼠因为大红细胞性贫血在出生前后死亡、生殖腺发育异常。
该小鼠不仅仅是Kit基因功能研究的好材料,也是研究生殖细胞发育、胚胎造血机制的理想模型。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物和饲养条件W-3Bao突变杂合子小鼠及其背景品系C57BL/6J(B6)小鼠由扬州大学比较医学中心及杭州师范大学实验动物中心提供。
实验动物生产许可证:
SCXK(浙)2005—0020,使用许可证:
SCXK(浙)2005—0071。
动物饲养在屏障环境的动物房内,饲喂浙江省实验动物中心小鼠全价饲料,自由采食和饮水,室内温度控制在(23±
2)℃,湿度控制在(55±
5)%,室内照明采用12∶12h明暗交替。
1.1.2主要试剂、引物及仪器LATaqpolymerase、
PyrobestTMDNAPolymerase购自宝生物工程(大连)有限公司;
QIAquickGelExactionKit购自QIAgen公司;
测序委托上海生工生物工程公司进行。
依据前期对突变基因鉴定的研究结果,本实验针对W-3Bao突变位点在基因组上的位置设计覆盖突变位点的PCR引物:
上游引物为5′-GAATGCTGGTAT-GTTGGAGG-3′;
下游引物为5′-ACAGGATGG-AAGAAAGAGGC-3′,预计扩增片段长为750bp(Xueetal,2007)。
PCR仪为BIO-RAD的PTC-200;
血常规检测仪为日本SYSMEX公司SYSMEX
KX-21。
1.2方法
1.2.1突变小鼠的繁殖方法与表型特征观察首先将W-3Bao突变杂合子小鼠互交,观察后代小鼠的表型变化,再将带有白斑的后代小鼠与正常B6小鼠交配,根据后代是否有正常小鼠判断亲代小鼠是否为突变基因纯合子。
随后,将W-3Bao突变杂合子小鼠互交,每日行阴道栓检查,见栓者记为孕0.5天,分别在孕10.5、12.5、14.5、16.5及18.5天剖检母鼠,肉眼观察胎鼠及初生小鼠的表型特征,对可疑的异常小鼠进行编号、基因型鉴定、血液学及组织病理切片检查。
1.2.2血液学检查将2月龄W-3Bao突变杂合子小鼠与背景B6小鼠公母各20只,眶静脉采血用于血涂片及血常规检测。
将胚胎18.5天小鼠断头采血
20μL,经0.5mL抗凝稀释液稀释后用SYSMEXKX-21血细胞自动分析器检测,待基因型鉴定后分组。
纯合子小鼠4只为观察组,杂合子和野生型共4只设为对照组。
采血同时,取适量血液做血涂片,瑞氏后染色后镜检。
数据统计方法为t检验。
1.2.3组织病理学检查2月龄正常B6小鼠及
W-3Bao杂合子小鼠各6只,每种小鼠雌雄各3只,脱颈椎处死,取脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、小肠组织、小肠淋巴结和生殖腺等主要脏器,用4%甲醛固定。
取18.5天胎龄的正常及苍白的整体胎鼠各6只,经Bouin液固定。
整体胚胎或组织块适当修剪后,常规脱水、浸蜡、包埋、6μm厚度切片(整体胚胎行连续切片,每10片取1片)、
HE染色和镜检。
1.2.4突变小鼠的基因型鉴定样本基因组DNA的准备:
将有待基因型鉴定的突变系小鼠编号并剪取0.5cm鼠尾,参考分子克隆手册,采用蛋白酶K消化、酚氯仿法提取基因组DNA(Sambrooketal2002)。
PCR扩增:
PCR反应体系为50μL,其中基因组DNA模板2μL,上游引物0.5μL(50pmol/μL),下游引物0.5μL(50pmol/μL),10×
Reactionbuffer(含
Mg2+)5μL,dNTP(10mmol/L)1μL,LATaqpolymerase(5U/μL)0.5μL,补灭菌超纯水至总体积50μL。
PCR反应条件:
94℃预变性3min;
94℃35s,
54℃35s,72℃80s,35个循环;
后在72℃延伸10min。
测序及基因型鉴定:
PCR产物胶回收后送上海生工测序部测序,测序结果用DNAstar比对寻找突变部位后,再用Chromas软件观察测序峰图,依据先前研究结果,Kit基因编码区第441位碱基处出现明显重叠波(T与A)为杂合子,出现单一T波为野生型,出现单一A波为突变纯合子小鼠(Xueetal,2007)。
2结果
2.1W-3Bao白斑小鼠的遗传实验
将W-3Bao白斑杂合子(图1)互交繁殖了30只小鼠,在子代小鼠中均未出现新的表型或见到白斑区域显著扩大。
将30只杂合子互交后代(有白斑)与正常B6配种,每一窝后代均见到正常毛色的子代小鼠,故推测这30只杂合子互交后代白斑小鼠均为杂合子,而纯合子小鼠可能在胚胎期死亡。
2.2W-3Bao小鼠的胚胎发育
图1W-3Bao突变小鼠
Fig.1TheW-3Baomutantmouse
突变基因杂合子表型为腹部、四肢末端及尾部末端白化,右侧为Kit突变位点(A/T杂合子)。
Theheterozygousshowswhitebelly,limbterminalsandtailtip.Rightpictureshowsthemutation,siteofKit,whichistheheterozygousofAandT.
将W-3Bao杂合子小鼠配种检栓,在孕10.5、12.5天剖检母鼠各5只,肉眼未见胎鼠异常;
至孕14.5
天,部分胎鼠身体稍白,大小形状基本正常;
孕16.5天,可见所有胎鼠存活、活动,部分胎鼠明显苍白、个体略小;
孕18.5天,胎鼠全部存活、活动正常,部分胎鼠明显苍白,个体矮小;
初生小鼠中常见死胎,存活小鼠外观正常,未见色泽苍白小鼠。
结合基因型鉴定,发现苍白胎鼠及出生死亡小鼠为突变基因纯合子小鼠,突变杂合子胎鼠与野生型小鼠外观无区别(图2,3)。
本实验一共解剖10只孕18.5天母鼠,获得胎鼠56只,其中色泽苍白小鼠12只,色泽苍白小鼠与全部胎鼠的比例与理论上纯合子小鼠数量相近,说明纯合子小鼠可以存活至孕18.5天至出生前后。
2.3血涂片及血常规检测
对2月龄左右的W-3Bao白斑小鼠与B6背景小鼠血涂片观察及血液常规分析未发现存在差异(结
图2部分标本Kit基因突变区基因组局部的PCR扩增产物
Fig.2PCRProductoflocalgenome
第1泳道为DL2000DNAmarker,第2、3泳道为Kit基因组扩增产物。
Lane1wasDL2000DNAmarker;
Lane2and3werePCRproductsoflocalgenome.
图3孕18.5天胎鼠外观及基因型鉴定
Fig.3Externalappearanceandgenotypesofmouseembryosof18.5-dayold
下列为18.5天胎鼠,上列为对应基因型;
中间两只胎鼠外观苍白,个体矮小,为突变纯合子小鼠;
左侧两只为野生型胎鼠,右侧两只为杂合型胎鼠;
野生型及杂合型色泽红润、形态大小正常,外观无明显区别。
Lower:
18.5-day-embryos;
Upper:
thegenotypesofcorrespondingmice.Thetwomiceinthemiddlearehomozygous,theylookpaleanddwarf.Therighttwomiceareheterozygousandthelefttwomicearewildtype,allofthemlookruddyandnormal.
果未显示)。
胚龄18.5天的野生型或突变杂合子小鼠血液色泽深红,镜下血细胞数量多,细胞大小形态正常。
与野生型相比,胚龄18.5天的突变纯合子小鼠血液颜色明显浅淡,血涂片中细胞数量较少,红细胞形状正常、直径显著增大(图4)。
血常规检测见突变纯合子小鼠的红细胞(RBC)数量、血红蛋白量(HGB),红细胞压积(HCT)显著低于野生型或杂合子;
突变纯合子小鼠的平均红细胞体
积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)显著高于野生型;
突变纯合子小鼠的血小板(PLT)数量低于野生型或杂合子;
经统计学检验,上述数据均有显著差异性。
结合血涂片观察,突变纯合子小鼠被诊断为大红细胞性贫血。
具体数值见表1。
2.4组织病理学观察
W-3Bao杂合子小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、
图4本研究中小鼠的血涂片
Fig.4Picturesofbloodfilmforthemicestudied
a:
突变基因纯合子小鼠W-3Bao/3Bao;
b:
野生型小鼠B6+/+。
瑞氏染色×
400。
a:
FromthehomozygousmouseW-3Bao/3Bao;
b:
FromwildtypemouseB6+/+.Wright’sstaining×
400.
表1本研究中小鼠的血常规检测结果
Tab.1Detectionresultsofbloodroutineitemsforthemicestudied
野生型及突变杂合子小鼠(X±
S)
Wildtypeandheterozygousmice
W-3Bao突变纯合子小鼠(X±
W-3Bao/-3Baohomozygousmice
P值(t检验))
Pvalue(ttest)
白细胞数量(WBC)(×
109)
5±
1.14
3.95±
0.57
0.10−0.20
红细胞数量(RBC)(×
1012)
3.12±
0.69
0.21±
0.09
<0.001
血红蛋白量(HGB)(g/L)
107.50±
18.43
20.5±
5.26
红细胞压积(HCT)(L/L)
0.341±
0.069
0.034±
0.015
0.01-0.02
平均红细胞体积(MCV)(f/L)
109.85±
6.68
154.25±
7.69
平均血红蛋白含量(MCH)(pg)
34.75±
2.21
100.25±
16.23
平均血红蛋白浓度(MCHC)(g/L)
316.50±
9.47
653.5±
130.47
0.002−0.005
血小板数量(PLT)(×
422±
127.24
112.5±
97.12
0.01−0.005
胸腺、肾上腺、小肠组织、小肠淋巴结和卵巢等主要脏器的石蜡切片均未发现显著异常;
睾丸大小基本正常,大多数生精小管发育正常,其内可见处于不同发育阶段的各级生精细胞;
少数生精小管内无生精细胞,只见支持细胞,管腔内含有分泌物,HE染色呈粉红色泡沫状(图5)。
18.5日龄整体胎鼠的连续石蜡切片中,生殖腺结构明显异常:
野生型雄鼠睾丸中精曲小管结构清晰,精原细胞位于精曲小管内及睾丸间质中(图6a,b);
W-3Bao/3Bao雄鼠精曲小管轮廓不清,部分有形成精曲小管趋势,精原细胞数量、形态与野生型相当,但这些细胞全部位于睾丸间质中,尚未迁入精曲小管(图6c,d)。
野生型母鼠卵巢,细胞排列呈团块状或条索状,卵原细胞深染,周围呈空泡状,形成原始卵泡结构(图6e,f);
W-3Bao/3Bao卵巢内细胞密集,弥散片状排列,未形成原始卵泡基本结构(图6g,h)。
骨髓、肝、脾等造血器官及其他器官未见显著异常(骨髓切片见图7)。
图5HE染色示W-3Bao杂合子小鼠睾丸结构
Fig.5TestisstructureofW-3BaoheterozygousmouseandcontrolbyHEstaining
a,b为B6+/+小鼠;
c,d为W-3Bao/+小鼠。
*示发育异常精曲小管;
HE染色。
a,c×
100,b,d分别为a,c黑框部分放大(×
400)。
aandbwereB6+/+mouse,canddwereW-3Bao/+mouse.Abnormalcontortedseminiferoustubulesaremarkedwith*.HEstaining,aandc×
100,bandd×
400fortheboxpartofaandcrespectively.
图618.5天小鼠胚胎生殖腺结构
Fig.6Genitalglandstructureofmouseembryoattheageof18.5day
a,b为B6+/+小鼠睾丸(以t示之),黄色箭头示精曲小管内精原细胞,黑色箭头示睾丸间质中精原细胞;
c,d为W-3Bao/3Bao小鼠睾丸,黑色箭头示睾丸间质中精原细胞,精曲小管内则无精原细胞;
e,f为B6+/+小鼠卵巢(以O示之),黑色箭头示原始卵泡结构;
g,h为W-3Bao/3Bao小鼠卵巢,细胞排列弥散,无原始卵泡结构。
HE染色,a,c,e,g×
200,b,d,f,h×
1000。
aandbwerethetestesofB6+/+mousemarkedwitht,yellowarrowsshowthespermatogoniumincontortedseminiferoustubules,blackarrowsshowthespermatogoniumininterstitialtissueoftestis;
canddwerethetestesofW-3Bao/3Baomousemarkedbyt,blackarrowsshowthespermatogoniumininterstitialtissueoftestisandnospermatogoniumliesincontortedseminiferoustubules;
eandfweretheovaryofB6
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