探讨中药功效成分合成生物学研究进展23800字Word格式.docx
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根据生物活性的起源这些中药功效成分可分为苯丙烷类(phenylpropanoids)、异戊二烯类(isoprenoids)、多聚酮类(polyketides)、生物碱类(alkaloids)以及黄酮类(flavonoids)[1]。
不同种类的中药功效成分在药物开发中均有应用,如抗疟疾药物青蒿素,用于治疗阿兹海默症的石杉碱A,用于治疗感冒的麻黄素、抗癌药物喜树碱以及对埃博拉病毒感染具有治疗效果的粉防己碱,在治疗肥胖中有巨大潜力的南蛇藤醇等[24]。
这些例子都展示了中药功效成分在疾病治疗与防御以及其他未解决的疾病方面有很大的应用前景。
目前,中药功效成分的获取途径主要有①直接从药源植物中分离提取;
②化学及半化学合成途径;
③基于作用机制了解清晰的基础上,寻求替代物;
④利用植物细胞或组织培养技术;
⑤微生物合成法。
直接从中药中分离提取有效活性成分是目前中药功效成分获取的主要途径。
但该方法过度依赖于中药资源,据统计,这些活性成分大约2/3来源于野生资源,而药用功效成分多为次级代谢产物,在植物中的积累量极低,如红参中稀有人参皂苷Rh2的质量分数低于0.001%[5];
虽然中药的栽培技术已日渐成熟,但其培养条件要求较高,且耗时耗力,生产成本高;
而通过化学合成,无论是化学合成或半化学合成的方法,都会受其特殊的化学结构如手性及不对称中心的限制;
利用药用植物细胞或组织培养,能够克服以上多方面问题,目前,以中药功效成分为生产目标的细胞工程数量大约有100多种,研究表明,约40种活性物质经组织培养,其含量甚至高于原植株水平,但大多数中药组培机制研究不甚清楚,而且受基因型以及细胞毒性,生产成本等限制,除了较为典型的例子如人参、紫草外,利用该方法进行工业化生产成功的例子并不多。
中药功效成分的微生物合成生物学法,即在系统生物学基础上,采用工程学的设计思路和方法,通过对相关功能基因的模块化设计及改造,并充分考虑合成过程中适配性的问题,将中药功效成分的合成过程或其前体物质的生物合成途径转移到微生物细胞中,利用微生物的发酵过程完成药用天然活性物质的高效异源的合成。
该方法主要是基于目标产物生物合成路径较为清晰的基础上利用微生物易于培养,不受环境影响且生长周期短,生产系统规范化,反应条件温和易于控制,产物成分较为单一,易于分离和提取以及环境友好等特点,解决中药功效成分来源稀缺,化学合成困难,以及造价高的一系列问题,为中药功效成分的工业化生产以及可持续利用提供了一个新的可行的方法。
因其在生产中所带来的巨大作用,"
合成生物学"
;
被誉为可改变世界的十大新技术之一。
本文将介绍中药功效成分合成生物学的应用及研究进展。
一、中药功效成分合成生物学进展
随着本草基因组学[6]、高通量测序结合分子生物学工具等的应用,大大加速了中药功效成分合成生物学的研究进展,在不同的底盘生物如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等,多种中药功效成分尤其是来源于药用植物的单体药物等都取得了巨大的研究进展。
1.1青蒿素
青蒿素的合成,从黄花蒿中提取青蒿素是目前获取青蒿素的主要途径,每年全世界对青蒿素的需求都在增加,而黄花蒿中青蒿素质量分数很低仅为0.01%~0.8%,单一从黄花蒿中提取青蒿素没法满足其巨大的需求。
随着参与青蒿素生物合成的各种酶基因不断得到克隆,通过转基因手段在植物体内促进其生物合成、或在微生物中重建其代谢途径的工作取得了较大的进展[717]。
2003年Keasling实验室[7]将优化后的紫槐二烯合成酶基因ADS导入大肠杆菌中,通过结合来自酵母的甲羟戊酸途径(MVA)的相关基因,首次合成了青蒿素的关键前体物质紫穗槐二烯,通过发酵优化,其产量达到了0.5g&
#12539;
L-1。
尽管经过不断的优化研究,大肠杆菌工程菌株产紫槐二烯的量达27.4g&
L-1[8],但是因为P450基因在大肠杆菌体内表达的受限,上下游代谢流的不匹配,使得团队将青蒿酸的合成从大肠杆菌转移到酵母菌株上来。
2006年,该团队成功鉴定了催化紫穗槐二烯到青蒿酸的关键基因细胞色素P450氧化酶基因(CYP71AV1),基因功能显示该酶催化紫穗槐4,11二烯的三步氧化,生成青蒿酸。
团队将ADS基因连同鉴定的CYP71AV1和与其相关的还原伴侣AaCPR基因同时在酵母中进行表达,成功构建了第一株产青蒿酸的酵母菌株,尽管青蒿酸的产量仍旧比较低,但是这一工作具有创新的意义[910]。
2008年Covello研究小组[11]发现青蒿醛&
Delta;
11(13)双键还原酶基因(DBR2)在青蒿的腺毛组织组织中表达量很大,克隆该基因其功能催化显示这一基因对于青蒿醛这一底物具有很高的活性。
研究团队在酵母中将DBR2基因连同ADS,CYP71AV1和CPR基因一起导入后,在酵母菌株中产生二氢青蒿酸。
Donald等[12]将截短了的3羟基3甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR1)基因(tHMGR)导入酿酒酵母中,增加了HMGR1的表达量从而使角鲨烯的合成量大大提高。
由于角鲨烯合酶(ERG9)促使法尼基焦磷酸(FPP)流向角鲨烯,相对的抑制了青蒿素的合成,因此,Ro等[9]通过抑制鲨烯合酶基因(ERG9)的表达减少FPP流向角鲨烯,使紫穗槐二烯产量提高了2倍。
Pitera等[13]研究小组通过增加HMGR和法呢酰二磷酸酯合酶基因(ERG20)的拷贝数,提高了紫穗槐二烯的产量。
另研究发现萜类调控因子蛋白UPC2是酵母细胞一个重要转录因子,调控固醇生物合成,对其进行过表达,能够提高紫穗槐的产量。
2013年,Keasling团队研究发现,相比UPC5,细胞色素b5基因(CYB5)能有效促进青蒿醇到青蒿醛的反应,而通过对青蒿腺毛转录组数据的分析,鉴定了乙醇脱氢酶基因(ADH1)和乙醛脱氢酶基因(ALDH1)分别是催化青蒿醇形成青蒿醛,青蒿醛形成青蒿酸的基因,这2个基因在酵母体内的表达,大大降低了青蒿酸中间产物青蒿醇和青蒿醛的产量,大幅度提高了终产物青蒿酸的产量,结合超表达上游MVA的所有基因包括乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(ERG10),HMGCoA合酶基因(ERG13),tHMG,甲羟戊酸激酶基因(ERG12),磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8),二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(ERG19),异戊烯基二磷酸异构酶基因(IDI)和ERG20同时通过启动子的替换将ERG9基因表达强度进行弱化以减少碳流走向三萜途径,青蒿酸合成途径的下游基因包括ADS,CYP71AV1,CYB5,ADH1,ALDH1等基因在酵母体内进行表达。
这些菌株改造结合优化的发酵策略,酵母产青蒿酸的产量达到了25g&
L-1,初步达到了工业化水平[17]。
除了增加通往青蒿素生物合成的代谢流,提高青蒿素的贮存能力也是解决青蒿素产量问题的一个有效途径[1415]。
青蒿素生物合成的工业化必将带来青蒿素生产方式的彻底变革,也是缓解日益严重的青蒿素短缺局面的根本出路。
同时,采用酵母发酵产青蒿素,其最终产物仅有青蒿素,目的产物含量高且单一,大大降低了后期分离纯化的成本。
1.2紫杉醇
紫杉醇是一种紫杉烷二萜类化合物,基本骨架为三环二萜[18]。
1971年首次由Wani等从短叶红豆杉Taxusbrevifolia树皮中提取出来一种次级代谢产物,具有低毒、高效的抗癌效果[19],自1992年上市以来,一直是治疗卵巢癌、乳腺癌等癌症的首选药物,是目前最好的抗癌药物之一,市场需求巨大。
目前,紫杉醇的生产方法主要包括源植物提取法[20]、化学合成法以及生物合成法。
紫杉醇的半合成法,是工业化生产紫杉醇的主要方法[2123],合成该技术已比较纯熟,但紫杉醇的生产仍受限于有限的红豆杉资源,无法满足市场需要;
利用合成生物学技术,通过微生物来合成紫杉醇的前体物质,再运用半合成法合成紫杉醇是目前应用前景最广阔的一种方法,经过多年的研究,已经取得了巨大的进展[5,7,2426]。
Huang等[24]将脱氧木酮糖5磷酸合酶基因(DXS)基因同IDI异构酶基因、&
#65533;
脚6&
基&
基二磷酸合酶(GGDPs)基因以及紫杉醇二烯合酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行共表达,以异戊二烯焦磷酸为原料进行发酵,合成了紫杉醇合成途径中的重要中间体――紫杉二烯,产量为13mg&
首次成功的在工程菌株中合成紫杉烯,为紫杉醇的微生物合成提供了基础。
Ajikumar等[25]利用代谢工程多元模块法,以异戊烯焦磷酸(IPP)为节点,将紫杉醇生物合成途径分为2个模块,即:
产IPP的内源性2甲基D赤藓糖醇4磷酸(MEP)途径的上游模块和合成异源萜类化合物途径的下游模块。
上游模块包括MEP途径的4个关键酶基因(dxs,idi,ispD和ispF),由操纵子(dxsidiispDF)控制过表达;
下游模块包括2个基因焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯(GGPP)合酶基因(G)和紫杉二烯合成酶基因(T)。
将下游模块导入底盘细胞中并过表达上游模块后,虽然紫杉醇二烯的代谢流有所增加,但其合成量极少(不足10mg&
L-1),因此,该研究小组采用"
多元系统搜索"
的方法寻找上下游模块平衡的最优组合,并通过改变质粒拷贝数和启动子强度的方法对下游模块的表达进行调节,使其达到最优化,最后紫杉醇二烯合成量最高达1.02g&
L-1,是紫杉醇中间体紫杉醇二烯合成量最高的报道。
Zhou等[26]通过大肠酵母共培养技术进行紫杉醇的微生物合成,首先在酿酒酵母BY4700中融合表达5&
alpha;
CYP(P450taxadiene5&
hydroxylase)基因和其还原酶基因CPR来催化紫杉醇合成过程中的第一个氧化反应,然后将培养基中的碳源由葡萄糖替换为木糖以解决共培养过程中乙醇对菌体及目的产物的抑制作用;
增加酵母接种量,将上述构建的酵母菌株中的融合基因5&
CYPCPR启动子替换为UASGPDp,在大肠杆菌中过表达葡糖胺磷酸乙酰转移酶(pta),乙酸激酶(ackA),并敲除atpFH和ACS基因以增加含氧紫杉烷类的合成量;
最后将更换了强启动子的TAT(taxadien5&
olacetyltransferase)基因和融合了一个CYP还原酶的10&
beta;
CYP(taxane10&
hydroxylase)基因在上述构建好的酵母菌株中进行共表达,最终含氧紫杉烷类合成量为33mg&
L-1,提高了酵母产紫杉醇前体产物的产量并为无法发在单一微生物中进行生物合成的化合物的合成提供了一种新的解决方法。
1.3人参皂苷
人参皂苷(ginsenoside)是由三萜苷元和糖、糖醛酸以及其他有机酸组成的三萜皂苷类化合物,是人参及西洋参的主要活性成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化作用[27]。
随着人参皂苷的生物合成路径的解析和相关酶的基因的克隆及鉴定,应用发酵菌株合成人参皂苷也取得了巨大的成功。
2013年,中国学者戴住波等[2829]将人参来源的达玛二烯合成酶基因(PgDDS),原人参二醇合成酶基因(CYP716A47)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)来源的AtCPR1基因,导入酵母菌株中,并对相关基因tHMG1,ERG20,ERG9,ERG1等进行了系统调控,同时对相关密码子进行优化成功构建出了产原人参二醇的工程菌株,原人参二醇的产量1.2g&
L-1,较原始出发菌株产量提高了262倍。
这是首次人参皂苷重要前提物质原人参二醇在酵母中实现从葡萄糖的合成。
接着该团队构建了同时可以生产原人参二醇、原人参三醇以及齐墩果酸的酵母菌株,其发酵产量可以生产17.2mg&
L-1的原人参二醇,15.9mg&
L-1的人参三醇以及21.4mg&
L-1的齐墩果酸,实现酵母细胞同时生产多种人参功效成分。
2015年,Zhou等[26]成功克隆出了糖基转移酶(UGT)的UGTPg1基因,该基因可以催化原人参二醇合成人参皂苷CK这一物质,CK被证实是人参皂苷进入血液中起功效的活性成分,在鉴定这一基因后,该团队在酵母细胞中组装了人参皂苷CK合成途径的基因,最终利用酵母细胞成功生产人参皂苷CK。
接着,基于人参的转录组数据,该团队在进一步的工作中鉴定了UGTPg45和UGTPg29这2个糖基转移酶的基因,UGTPg45在原人参二醇的3号碳位的羟基上加入葡萄糖,形成人参皂苷Rh2,UGTPg29则是进一步催化人参皂苷Rh2形成人参皂苷Rg3,验证此2个基因的催化功能后,在酵母细胞中组装原人参二醇合成基因以及UGTPg45和UGTPg29,最终成功构建了产人参皂苷Rh2和Rg3的酵母菌株,尽管目标产物的生产浓度还比较低,都在&
mu;
mol&
gDCW-1的水平,但是这些工作为昂贵的单一人参皂苷生物合成提供了坚实的基础。
1.4丹参酮
丹参酮是丹参中一类从唇形科植物丹参中提取得到的具有显著药理活性的脂溶性二萜化合物,包括丹参酮I、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异隐丹参酮等10余种化合物,具有抑菌,抗炎,抗凝血等作用,是国际上广泛认可的用于治疗心脑血管疾病的天然药物之一[3031]。
二萜类化合物合成来自2个常见的前体物质:
IPP和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)模块,它们在酵母中通过MEV途径合成。
而大部分IPP和DMAPP前体物质进入麦角固醇合成路径。
在此基础上,研究者们通过多种合成生物学策略来提高酵母中合成丹参酮的量,例如Dai等[32]研究表明过表达tHMGR基因和突变监控因子基因(upc2.1),可以增加FPP的供给量,但次丹参酮二烯合成量并未增加,反而积累了大量的鲨烯(78mg&
L-1)。
与此相反,通过过表达融合基因FPP合酶(ERG20)和内源性的GGPP合酶基因(BTS1)以及来自酸热硫化叶菌的异源性的GGPP合酶基因(SaGGPS),次丹参酮二烯产量增加到了8.8mg&
过表达ERG20BTS1和SaGGPS基因将次丹参酮二烯产量从5.4mg&
L-1增加到了28.2mg&
过表达tHMGRupc2.1和ERG20BTS1SaGGPS在产次丹参酮二烯时具有协同作用,次丹参酮二烯产量61.8mg&
L-1,最后经流加培养发酵,次丹参酮二烯产量488mg&
L-1,为丹参酮的生物合成奠定了基础。
丹参生物合成路径中的共同前体物质――次丹参酮二烯是由SmCPS和SmKSL催化合成。
高伟等[3334]首次克隆了编码丹参柯巴基焦磷酸合酶(SmCPS)、丹参类贝壳衫烯合酶(SmKSL)的全长基因,随后将这2个基因通过模块组合的方式将SmCPS和SmKSL以及BTS1,ERG20,tHMG等5个基因导入酵母底盘细胞中,次丹参酮二烯产量达到365mg&
Guo等[3536]鉴定了14个与次丹参二烯生物合成相关的CYP450基因,将CYP76AH1及来自于丹参的细胞色素还原酶基因SmCPR1和SmCPR2基因整合到产次丹参酮二烯的工程菌株中,铁锈醇合成量为10.5mg&
L-1,同时发现铁锈醇的产量和次丹参酮二烯的积累量呈负相关。
随后通过进一步的共表达分析,又发现了丹参酮生物合成分支路径上的2个新的P450还原酶基因CYP76AH3和CYP76AK1,并通过生化方法以及RNA干扰技术表明CYP76AH3在2种不同的碳中心使铁锈醇氧化,CYP76AK1羟化产生的2个生成的中间体的C20,最终将铁锈醇氧化为11,20二羟铁锈醇,11,20二羟柳杉芬,进一步实现了对丹参酮中间产物的发现。
1.5红景天苷
红景天苷(salidroside)是一种多元皂苷,为红景天Rhodiolarosea(也称为"
西藏人参"
)植物中最为重要的生物活性成分[3738],具有多种生理调节属性,如抗氧化、抗微波辐射、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤以及抗衰老等[3940]。
然而红景天生存环境恶劣(一般生长在高海拔寒冷地区),传粉困难且生长缓慢,加之近年来的过多开发,野生红景天的资源正在枯竭的边缘[41],此外,红景天中红景天苷的质量分数相对较低,仅为0.5%~0.8%,远不能满足人们日益增长的需求。
研究表明,红景天苷属于酪氨酸代谢产物,其合成路径解析已较为清楚:
来自于莽草酸途径的L酪氨酸通过酪氨酸脱羧酶(TDC)转化为酪胺;
随后酪胺在酪醇氧化酶(TYO)和乙醇脱氢酶(ADH)的连续催化作用下进一步转换成红景天苷的苷元――酪醇[42],随后酪醇和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)在尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDPglucosyltransferase,UGT)催化作用合成红景天苷。
Bai等[43]成功运用酵母丙酮酸脱羧酶(ARO10),内源性ADHs,来自红景天的糖基转移酶UGT73B6,第一次成功地在大肠杆菌中合成了红景天苷。
随后经过一系列的基因操作,包括灭火特异性转录调节基因tyrR,删除丙酮酸激酶基因pykA和pykF以及分枝酸变位酶/预苯酸脱水酶基因pheA,过表达编码L络氨酸途径中各种酶的基因,包括分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的反馈抑制突变基因tyrA(tyrAxsyn),脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶的反馈抑制突变基因,即aroG(aroGxsyn),磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(ppsA),转酮醇酶(tktA),莽草酸脱氢酶(aroE),3脱氢奎尼酸脱水酶基因(aroD)和优化后的3脱氢奎尼酸合酶基因(aroBop),有效的提升酪醇生产效率,红景天苷最高产量达56.9mg&
L-1,为红景天苷合成提供了一个操作简单,经济效益高的,可用于大规模生产的方法。
另外,该研究同时还表明从红景天中提取的糖基转移酶UGT73B6通过将葡萄糖添加到酪醇的酚醛位置来催化淫羊藿次苷D2的形成,这是关于淫羊藿苷的产物生物合成的报道。
二、中药合成生物学策略
合成生物学是一门在基因工程、代谢工程等经典学科上发展起来的整合学科,是一门将生物学工程化的学科,其目的在于将复杂的自然生物代谢系统改造为由简单的可控的模块或零件,经计算机辅助设计对其进行模拟预测,从而构建出由天然或非天然的功能元件或模块组成的生物系统,实现生物系统在各领域的模块化应用。
其基本思路是:
首先,根据目标产物选择合适的底盘细胞,之后将设计好的目标产物合成途径在底盘细胞中进行重建,对所创建的合成途径进行模块式优化,并根据目标产物的产量调整优化策略,以达到合成途径和底盘生物的最优化适配,最终实现目标产物的大量合成。
2.1中药功效成分合成路径的创建
目前,中药功效成分的合成途径构建可以分为2种模式,第一种模式是在充分了解目标天然代谢产物代谢途径的基础上,根据研究目的,将目的产物所在基原物种的生物合成途径转移到微生物中,利用底盘细胞中原有的或者重新构建的代谢途径大量生产目标产物;
另一种模式是根据目标产物或其合成过程中的中间体的化学结构,利用已挖掘基因元件的功能,实现对目标产物的合成甚至生产自然界中不存在的化学物质。
2.1.1原代谢途径的直接转移对原代谢途径的直接转移,重构和工程化这种模式对新代谢途径的构建可分为3种方式[44]。
第一种方式是将来源不同的与目标产物合成有关的基因整合到底盘细胞中,利用底盘生物的主要和次要代谢所提供的前体物质,然后通过异源基因的表达将其转化为目标产物。
这种基于基因工程基础上的构建方式是目前最为简单的构建方式,被广泛的应用到了不同的底盘细胞中去,但它的目的主要是对所设计的代谢途径在不同底盘细胞中重构的可行性进行检验。
第二种代谢方式也是基于底盘细胞固有的中间体供应机制,在第一种方式的基础上,还导入了中药功效成分生物合成模块和底物调控模块,通过调节底物合成量来达到提高目标产物的合成量。
如Dai等[2829]在构建产原人参二醇的工程菌株时,除了导入PgDDS,CYP716A47以及AtCPR1基因外,同时通过对相关基因tHMG1,ERG20,ERG9,ERG1等进行了系统调控,原人参二醇的产量1.2g&
L-1,较原始出发菌株产量提高了262倍;
Donald等[12]将截短了的HMGR1基因(tHMGR)导入酿酒酵母中,增加了HMGR1的表达量从而使青蒿素的前体物质角鲨烯的合成量大大提高。
第三种方式是在前2种方式基础上,同时导入底物合成模块、底物调控模块以及中药功效成分生物合成模块,这种方式可以不依赖于底盘细胞的底物供应,既可以在无底物供应的情况下完成目标产物或其前体物质的合成外,还可以同时利用底盘细胞供应的前体以及新引入的底物供应途径提供的底物进行目标产物及其中间体的合成。
最经典的是Keasling实验小组在构建的产紫穗槐4,11二烯的大肠杆菌中,将来自于酿酒酵母的甲羟戊酸合成模块(底物调控模块)、FPP合成模块(底物合成模块)以及紫穗槐4,11二烯合成模块(中药功效成分生物合成模块)这3个模块同时导入底盘菌株中,成功构建了产青蒿素前体物质紫穗槐4,11二烯的工程菌株,后经优化操作,紫穗槐4,11二烯产量达27.4g&
L-1[10]。
Ajikumar等[25]将紫杉醇生物合成途径分为2个模块,即:
产IPP的内源性MEP途径的上游模块和合成异源萜类化合物途径的下游模块。
将下游模块导入底盘细胞中并过表达上游模块,经最后优化后,紫杉醇二烯合成量最高达1.02g&
2.1.2产目标中药功效成分的新合成路径的创建这种模式是基于对所需合成的目标产物或其中间体的化学结构了解比较清楚的情况下,在底盘细胞中对中药功效成分或中间体的合成路径进行重新设计,然后根据这条路径从基因数据库中筛选出与目标产物合成有关联的酶基因,将这些酶基因导入受体细胞中,在底盘细胞中进行组装、表达,从而构建出一条全新的、与原植物中的合成路径相差很大的合成路径。
采用这种模式构建的代谢途径与原底盘细胞中固有的代谢途径相差比较大,不需要对代谢途径有太深入的了解。
上述1.5项中红景天苷和淫羊藿苷的合成都是这一方式的典型案例。
2.2对中药功效成分合成路径计算机模拟设计
当选定要生产的目标产物时,首先要确定该产物的最优合成途径。
伴随着新一代的测序技术以及生物信息学分析技术的发展为合成路径的发现提供了一个新的选择,即参考代谢流分布,设计一些启发式的假设
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