细胞培养标准操作程序(SOP).doc
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细胞培养标准操作程序(SOP).doc
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细胞培养标准操作程序(SOP)
1.目的:
为了保证培养细胞的正常生长,实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤,特制订实验室细胞培养操作流程。
2.适用范围:
适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3.操作规程:
3。
1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制
3.1.1 1000ml培养液的配制
1、准备用品:
培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2~3天内的新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2~3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min.
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)溶解,并冲洗袋内残留粉末.
3、充分搅拌,按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI—1640配制1000ml需加NaHCO3粉2。
0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等),再充分搅拌.无需加谷氨酰胺,因该培养基里已含有。
4、用1M(1mol/L)HCl 调PH至7。
0左右(细胞适宜在PH7。
2~7。
4生长,配制好后PH值会升高0。
2~0。
3,故配时调PH至7。
0左右)。
5、用新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)定容到1000ml.
6、配青霉素 80万/瓶 +4ml 蒸馏水 溶解
配链霉素100万/瓶 +4ml 蒸馏水 溶解
取0。
5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中,使其终浓度均为100U/ml,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中,玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放—20℃保存备用.
注意:
(1)配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和(或)NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)配制。
一般于配制当天制备,以保证水的纯度和质量。
(2)准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌!
烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗
水)的容器均不需高压灭菌,干净即可.
3。
1.2 PBS(平衡盐溶液)的配制
NaCl 8g
KCl 0。
2g +新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000ml
Na2HPO4*H2O 1.56g
KH2PO4 0。
2g
(1) 无需调PH值,其成分溶解后PH为7。
4,不需除菌滤膜过滤除菌,放于4℃保存,用前直接高压灭菌(高压时,装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!
)
(2) Na2HPO4*H2O 1.56g 则Na2HPO4*12H2O需3。
4888g
(3) 如欲配制500ml,以上成分减半即可
3.1。
3 0.25%胰蛋白酶的配制
胰蛋白酶粉 2。
5g
EDTA(乙二胺四乙酸二钠) 0.3g
NaCl 8。
0g
KCl 0。
4g ` +新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)至1000ML
NaHCO3 0.5g
Glucose(葡萄糖) 1。
0g
酚红 0.06g
(1)配出来的PH值为7.6,在PH值7。
6~7。
8范围内,故不需调PH值.
(2)用0.22um的除菌滤膜过滤分装,瓶口用薄膜封口,放-20℃保存备用。
4℃可连续使用1月左右.
(3)用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌!
而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。
(4)如欲配制500ml,以上成分减半即可
3.2 细胞复苏
1、准备:
紫外线照台30min,准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸;培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。
在操作台上摆放好物品,左边为饭盒、培养液等,中间为酒精灯、试管架等,右边放滴管架、镊子,右上角放废液缸。
2、灼烧培养瓶口及瓶盖,用滴管取培养基5ml加入试管中(一滴约为50ul).
3、戴手套,从—196℃液氮罐中取出冻存管,立即放入37℃水浴箱中快速解冻,同时不断轻轻摇动冻存管,保证冻存管内细胞1min内融化。
以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
(慢冻快融)
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液,加入到已装有培养基的试管中,塞子塞试管,800rpm离心2min(用培养基且离心的目的:
去除细胞冷冻保护剂DMSO,因常温下其对细胞毒性大),弃上清,试管底部的白色物质为细胞,轻弹混匀。
往试管中加培养基、FBS(胎牛血清)各80滴和20滴(使FBS浓度为20%)。
用吸细胞液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,以免在培养瓶里成团,影响细胞生长.
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出,加到培养瓶中,标记日期、细胞名称,再把培养瓶放入CO2培养箱。
(注意:
加入到培养瓶后,培养瓶轻轻平放,用手拿培养瓶侧壁,左右上下轻轻摇晃几次,使细胞均匀贴壁在培养瓶底。
)
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面整洁。
注意:
(1)入细胞室前观察CO2%压力,5—7。
5mPa左右,减压器表压力不低于0.1mPa!
(2)刚复苏的细胞需要的营养成分更多些,让FBS浓度达到20%.
(3)离心时间为1~2min,速度为800转,不要离心太久,避免对细胞伤害较大。
(4)滴管使用注意事项:
a.吸细胞液专用一个滴管,各株细胞的滴管一定要严格分开,不能混用,防止细胞间污染.
b。
培养基和FBS(胎牛血清)可以用一个滴管,但分开用更好!
c。
FBS(胎牛血清)不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用.
d.胰酶和PBS(平衡盐溶液)可以用一根滴管,不过最好分开
(5)不是所有的细胞复苏后都能活。
死亡原因:
冻存时间太长(如2年以上),技术不过关(如吹打太激烈)、细胞传代数太多等.
(6)关于PBS(平衡盐溶液):
a。
PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用;PBS高压时其瓶塞一定要插针头.
b。
PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质,但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。
PBS虽然冲洗杂质效果较好,但它有使细胞易脱壁的倾向,故不可经常冲洗细胞。
c.不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备,使细胞加入胰酶后易消化.
d.消化后暂时不养细胞的培养瓶,可以往其中加入2~3mlPBS(防止培养瓶干燥),培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。
下次用该培养瓶再养同种细胞时,把PBS吸出弃去,再用培养基冲洗一遍即可再用。
(7)DMSO(二甲基亚砜)在常温下对细胞毒性较大,而在4℃时,其毒性大大减弱,故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO(离心后弃去上清),防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性!
3.3 细胞换液
1、倒置显微镜下观察细胞生长状态:
a.移动细胞培养瓶时,观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞;
b。
生长状态良好的细胞:
透明度大、折光性强、轮廓不清;能看清部分细胞细微结构,细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。
c.生长状态不良的细胞:
细胞折光性变弱,轮廓增强,胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质,细胞间空隙加大,细胞变得不规则,失去原有特点。
d。
只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。
2、紫外线照台30min,准备好吸管、试管饭盒,温育培养基,FBS(胎牛血清)可不温。
实验开始时打开照明灯和抽风机,用75%酒精喷双手.酒精灯点燃放中间。
滴管放滴管架上,从左到右顺序为:
吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS(胎牛血清)的滴管.从水浴箱中取出培养基,擦干水放入操作台的左边.
3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶,在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处(注意不要把胶盖烧焦),滴管(前端90%部位)灼烧。
细胞培养瓶倾斜,用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中,尽量吸干净。
注意:
滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内,避免产生气泡,且不要伸入瓶内太多,防止造成污染;滴管尖端悬空弃液,不要触到废液碗(要亲眼看到弃液,防止滴管尖端触到废液碗)!
4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶(25c㎡)中,再用吸FBS(胎牛血清)的滴管吸取FBS10滴加入到培养瓶中。
(使FBS浓度为10%)
5、旋紧细胞培养瓶盖后,再旋回半圈,以利于空气流通.平放回CO2培养箱中。
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面整洁。
注意:
(1)在打开培养基、FBS(胎牛血清)、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖,严格注意无菌操作.灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开.
(2)镊子每次使用前均需灼烧。
装FBS的瓶子瓶盖小,用镊子夹住盖子灼烧后,再用其夹住瓶盖盖上;取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。
(3)滴管在第一次使用前也需灼烧。
注意:
除吸取细胞液的滴管外,其他滴管滴加液体时都要悬空滴加.已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧!
滴管千万不能混用!
(4)培养瓶口不要对着自己,不加试剂时要平放。
(5)培养液以没过细胞为宜。
(6)细胞液颜色变黄,死细胞多时换液.不要求每天换液,容易增加污染机会.
3。
4 细胞计数
1、原理:
(1)计算细胞数目用血球计数盘计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0。
1mm=1。
0x10-4ml。
使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目.
细胞数/ml=4大格细胞总数/4×104
注意:
镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。
2、计数方法:
(1)75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板,再用干纱布或棉签再擦一遍,放好盖玻片。
(2) 用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中取一滴滴在计数板周边,再用加样枪吹打混匀该滴液体,从中吸取13ul至盖玻片边缘(注意不要溢出,不要有气泡).
(3) 观察计数:
压线的记左不记右,记上不记下;成团的细胞只记为1个;先用低倍镜(红色,4×)找出大位置,再用中倍镜(黄色,10×)进行计数。
细胞数/ml=4大格细胞总数/4×104
(4) 计数完毕用75%酒精棉签擦盖玻片及计数板,再用干纱布(或干棉签)擦一遍。
3.5 细胞传代
1、紫外线照台30min,准备好细胞培养所需物品。
2、取灭菌试管1支,配完全培养基(含10%FBS)3ml(培养基:
FBS=54滴:
6滴).
3、用吸细胞液的滴管吸弃旧液。
4、胰酶消化:
加入约1ml(20滴)胰酶到培养瓶里消化。
胰酶铺平培养瓶底为佳。
倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大,但未脱离培养瓶底,立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去,把细胞培养瓶放入CO2培养箱让残存的胰酶继续消化,(在37℃胰酶消化效果最佳).
5、每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察,当观察到细胞变圆,透亮,细胞间隙明显增大时,用吸细胞液的滴管从试管中吸取事先配好的完全培养基3ml加入到培养瓶中终止消化。
6、用吸细胞液的滴管轻柔吹打,保证培养瓶底的每个角落都吹打到,斜坡处不能忽略(可以把滴管卡在瓶口处吹打斜坡处。
吹打时尽量避免产生气泡,因其对细胞有伤害;需轻柔吹打,用力吹打对细胞也有伤害。
新学者可固定每个角落包括斜坡处吹打5次,靠近瓶口端处的角落也要吹到),把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入试管中,再用滴管吹打混匀细胞悬液.
7、取一滴细胞悬液进行计数(此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略。
如需进一步进行铺板则一定要计数!
)
8、传代:
不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1:
5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀3ml(60滴)细胞悬液,取12滴细胞悬液到培养瓶中,补足完全培养基(培养基:
FBS=9:
1)使液体总体积达到4ml,平放到CO2培养箱中继续培养。
9、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台,擦台,保持台面整洁。
注意:
(1)对于难消化的细胞(如Bxpc-3胰腺癌细胞)在用胰酶消化前,先用1~2ml(即20~40滴,或1~2滴管)4 ℃PBS冲洗一遍,较易消化的细胞不需要此步骤.
(2)一定要防止细胞过消化!
因过消化,使细胞成团,不均匀,且对细胞伤害很大,影响细胞贴壁和导致生长状态差等。
* 过消化特征:
a。
在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落,胰酶里出现很多悬浮物,为掉下来的细胞.
b.培养瓶底板上本身为白茫茫(细胞贴壁生长),而过消化后细胞脱壁掉下来,则可见培养瓶底板有一片片空隙。
(3)过消化的处理:
不吸出胰酶,立刻加入3ml完全培养基终止消化后一并收集入试管中,经过800rpm 离心3min,弃去上清(失活的胰酶、培养基、FBS)。
细胞沉淀(白色沉淀物)在试管底,用手指轻弹打散细胞,重新加入适量完全培养基,混匀后放入培养瓶中继续培养。
(4)在加入未经37℃温育的胰酶(指仅为室温)消化细胞时,即使细胞已经变圆,且透亮,用完全培养基终止消化后仍很难吹打下来.那是因为胰酶的温度不适宜;而应该把残留有胰酶作用的培养瓶放到CO2培养箱中,放置5min,让胰酶在其最佳温度(37℃)下消化细胞。
(5)把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时,每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体,以防止细胞成团不均,影响在培养瓶中生长。
(6)用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害,故应轻柔吹打并尽量减少气泡产生.
(7)吹打结束使细胞尽量分离成单个细胞为宜。
(8)完全培养基为含有10%FBS(胎牛血清)的培养液(基)。
(9)小牛血清使用范围:
5~20%,10%最常用。
血清可控制细胞生长速度,若想减慢细胞生长速度可减少血清浓度,反之亦然。
对于刚复苏的细胞需要的营养成分更多些,则血清用20%。
(10)一般25c㎡培养瓶需培养液5ml,通常需90滴培养基+10滴胎牛血清(FBS),一滴液体体积为50ul,即20滴为1ml。
(11)一般细胞生长铺至瓶底约80%,则可传代或用来做实验,否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化,不易用于后续实验。
3.6 细胞铺板(如12孔板)
1、紫外线照台30min,准备好细胞培养所需物品。
2、在灭菌试管1中配完全培养基3ml(培养基:
FBS=54滴:
6滴)
3、消化同前,注意防止过消化。
吹打混匀计数,如为:
8。
0×10 5个/ml
4、稀释细胞悬液:
根据经验,细胞密度0.8×10 5个/ml较合理,因每孔需加培养液1ml,共需12ml,分2次,每次6ml(因试管体积有限,6ml即120滴),则配制细胞悬液:
8。
0×10 5个/ml×xml=0.8×10 5个/ml×6ml,x=0。
6ml
即 细胞原液:
0.6ml×20滴/ml=12滴
完全培养基:
6ml—0。
6ml=5。
4ml (5.4×20滴=108滴)
97滴培养基+11滴FBS
故取12滴细胞悬液、108滴完全培养液加入试管中。
用吸细胞液的滴管吹打混匀细胞悬液。
5、在超净工作台里打开细胞板,铺板,注意无菌操作.每孔1ml(20滴),分4次滴加,每次5滴,按顺序依次滴入。
注意:
每次从试管中吸细胞悬液时都应吹打以使细胞均匀!
6、继续稀释细胞悬液6ml,操作同前。
7、加完之后,小心平稳地将培养板放入培养箱内,静置5min后,在显微镜下观察细胞是否铺均匀,如不均匀,将影响后续实验,则需在细胞板内吹打混匀细胞:
因孔内细胞悬液1ml,采用700ul枪吹打(不能用滴管,会刮花底面),可以轻轻抵着底面往各个方向吹打。
注意:
小心吹打,最好不要起气泡,否则会导致细胞不均,且影响观察.吹打后放倒置显微镜下观察,若不够均匀,继续吹打。
将细胞板拿出操作台时需盖板盖,避免污染。
8、吹打完毕后,小心将细胞板放CO2培养箱培养。
(注意:
拿细胞板避免晃动,最好直拿直放,不要推动移动,否则细胞容易成团.)
9、清洁操作台面,用75%酒精喷洒操作台,擦台。
注意:
(1)若铺96孔板,则需在96孔板周围一圈孔中加入PBS,防止干燥。
(2)各种不同规格板的铺板细胞数量:
板型
细胞密度(孔)
体积/孔
需细胞数
吹打加样枪头
6孔板
0。
6~0。
8×10 5个/ml
2ml
4×10 4
1ml
12孔板
0.6~0。
8×10 5个/ml
1ml
6~8×10 4
700ul
24孔板
0。
8~1。
0×10 5个/ml
0。
5ml
4~5×10 4
300ul
96孔板
1。
0×10 5个/ml
0.1ml
1×10 4
50ul
3。
7 细胞冻存
1、冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80–90%致密度.
2、依细胞传代培养之操作,收集培养之细胞于试管中,取少量细胞悬浮液,计数细胞浓度,一般冻存细胞浓度约1~5×106 cells/ml,依细胞种类而异.
3、用试管塞塞住试管,配平,800rpm 离心3min,去除上清液,加入适量完全培养液,使细胞浓度为1~5×106cells/ml,混合均匀。
4、吸取16滴细胞悬液到冻存管中,再加入2滴FBS,2滴DMSO(二甲基亚砜,为细胞冻存保护剂),使FBS浓度为20%,DMSO浓度为10%。
盖紧冻存管盖,在壁上标记好冻存细胞名称、冻存年月日。
5、把冻存管放到-70℃冰箱程序降温盒中24小时(勿超过1周),然后转移到-196℃液氮罐中长期保存。
注意:
(1) 注意冷冻保护剂之品质.DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0。
22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如SigmaD—2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。
(2)冷冻保存之细胞浓度:
①normalhumanfibroblast:
1~3×106cells/ml
②hybridoma:
1~3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherenttumorlines:
5~7×106,依细胞种类而异.Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④othersuspensions:
5~10×106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。
(3)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backupculture,以防止冷冻失败.
(4)DMSO(二甲基亚砜)在常温下对细胞毒性较大,而在4℃时,其毒性大大减弱,且能以较快的速度渗透到细胞内,故冻存细胞时使用室温下的DMSO,在冻存的细胞复温后,应及时洗涤冷冻保护剂DMSO(离心后弃去上清),防止DMSO对细胞产生毒性.
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