TPM13SSR技术在梨遗传多样性研究中的应用.docx
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TPM13SSR技术在梨遗传多样性研究中的应用
TP-M13-SSR技术在梨遗传多样性研究中的应用
摘要:
利用在SSR扩增产物检测过程中的一种基于荧光测序技术的高通量低成本分析技术体系TP-M13-SSR(simplesequencerepeatwithtailedprimerM13)对5个种25份梨种质资源材料进行了SSR标记的遗传多样性研究。
利用NHOl3a和NH007b2对引物即可区分所有供试品种,5对引物的区分率平均为76%。
25份材料在5个SSR位点的遗传多样性、多态性信息含量和位点杂合度的变化分别为0.6560―0.83460、0.6398―0.8149和0.4348―1.0000。
新疆梨的遗传多样性水平和多态性信息含量最低,平均值分别为0.7160和0.6812;秋子梨最高,平均值分别为0.7720和0.7379。
TP-M13-SSR方法具有经济、灵敏、高效等优点,在梨遗传多样性研究中应用效果好。
关键词:
梨:
TP-M13-SSR;遗传多样性
中图分类号:
S661.2 文献标识码:
A 文章编号:
1009-9980(2011)03-394-06
中国是世界梨属植物的起源中心之一,种质资源丰富,遗传基础广泛。
而其遗传多样性分析是种质资源研究的重要内容之一。
它作为生物多样性的重要组成部分,是生态系统多样性和物种多样性的基础,任何物种都具有其独特的基因库和遗传组织形式,物种的多样性也就显示了基因的多样性。
因此,遗传多样性分析是了解种质资源遗传基础的重要途径,同时还可以为种质资源在育种研究和实践应用中提供参考和指导。
中国梨属植物种质资源的研究始于20世纪50年代,形态学、细胞学和同工酶等方面的研究都曾在梨属种质资源的品种鉴定、亲缘关系和分类研究中起过积极的作用。
分子标记技术的发展,为种质资源的研究提供了一种准确、高效、快捷的途径,近些年也被逐渐地运用到梨属种质资源的上述研究中。
Hamada等最早发现了由二核苷酸CA/GT重复多次的一段DNA序列,Litt等首次将SSR技术(simplesequencerepeat,又称microsatellite)用于进行人类遗传学研究。
SSR技术以其多态性高、重复性好、共显性、检测简单等优点,在其他果树树种的品种鉴定和亲缘关系等方面得到了广泛应用。
SSR方法鉴定梨遗传多样性,国内外学者进行过的研究中主要是采用放射性标记或银染技术,其缺点是难以读取扩增片段大小,尤其是在大规模、多批次的数据收集和分析时仍存在相当大的难度,如不同等位变异的准确识别及不同批次反映数据的统一。
荧光测序技术在SSR-PCR产物检测上的应用,实现了数据收集和处理的自动化,克服了银染法的不足。
但其一个重要限制因素是其成本过高,一旦实验需要增加另外的SSR位点时,又必须得重新合成新增位点的荧光引物,该技术也仅仅在少量材料和较少位点的研究中应用较多。
Oetting首次将一段19bp的核苷酸序列(称为Tailedprimer,即尾巴引物)引入到短串联重复(shorttandemrepeat,STR)标记体系中,并与荧光分析技术和多重PCR(MultiplexPCR)技术相结合。
Schuelke又用M13序列作为尾巴引物,对该技术体系进行了完善,最终实现了SSR技术与荧光自动测序技术的完美整合,形成了一套低成本的基于荧光测序技术的SSR扩增产物检测体系,即TP-M13-SSR技术。
其在较大程度上解决了分析通量较低、扩增产物检测流程繁琐、数据记录的工作量过大等一系列问题。
此方法已经被应用到玉米、高粱等作物的遗传多样性、基因型鉴定等研究中。
我们对我国5个种的梨种质资源进行TP-M13-SSR的遗传多样性分析,旨在为今后梨种质资源的遗传多样性研究提供一种更加准确、高效的检测方法,并为其收集、保存、鉴定、评价等提供理论依据。
1、材料和方法
1.1 材料
应用TP-M13-SSR技术进行遗传多样性研究的白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨和选育品种共计25份材料,均取自中国农业科学院果树研究所国家果树种质兴城梨资源圃。
1.2 方法及数据处理
1.2.1 基因组DNA的提取 采用德国QIAGEN的DNeasyPlantMiniKit提取供试材料的基因组DNA。
1.2.2 引物合成 在TP-M13自动荧光检测系统中,用3条引物进行PCR扩增。
第1条引物是把普通SSR引物的正向引物分别和M13的反向引物相连合成带有M13尾巴的引物,即TP-M13引物;第2条引物为正常的SSR反向引物:
第3条引物是5’端带有荧光标记的M13正向引物。
选用的24对普通的SSR引物均来源于Yamamoto等、R,Liebhard等报道的序列,TP-M13-SSR引物由上海Sangon公司合成,5’端带有荧光标记的M13正向引物(其名称及序列见表1)则由美国ABI公司合成。
1.2.3 实验程序 TP-M13-SSR引物的2条引物序列之间具有19bp的差别,因此这种不对等性使得在应用TP-M13-SSR检测技术时,必须严格控制PCR反应的退火温度,最好是为每1对带M13尾巴的引物确定出最适退火温度。
在实际运行过程中,各引物的确切退火温度可以通过梯度PCR方法来确定。
为得到最佳的TP-M13-SSR扩增效果,PCR反应分2步进行,第一步为TP-M13-SSR引物的扩增获得PCR产物,第二步为5’端带有荧光标记的M13正向引物的扩增,实现SSR扩增产物的荧光标记。
所采用的PCR反应体系也必须经过优化,带尾巴序列的引物即F链的用量应该小于或等于不带尾巴序列的引物即R链的1/4,带荧光基团的通用引物(M13)在量上必须与不带尾巴序列的引物保持相等。
在筛选引物时,一般都是先用PAGE检测尾巴引物的扩增效果,然后选取扩增效果理想的扩增产物进行荧光检测。
其方法参照Schuelket221提供的巢式PCR,经优化后:
第1次扩增。
1)PCR反应体系模板DNA(20mg?
L-1)2μL,F-primer(2μmol?
L-1)0.12μL,R-primer(2μmol?
L-1)1.2μL,10xPCRbuffer(不含Mg2+)1μL,Mg2+(25mmol?
L-1)0.8μL,dNTP(25mmol?
L-1)0.1μL,Taq酶(5U?
μL-1)0.12μL,ddH2O4.66μL,Total10μL。
2)降落PCR反应程序。
引物对梨种质资源的扩增经优化,采用降落PCR程序,扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性45s,起始An.T退火45s,72℃45s,10个循环,其中每个循环降0.5℃;94℃45s,降落至最后的温度退火45s,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸10min;4℃保存。
第2次扩增。
1)PCR反应体系以第1次PCR产物为模板,在其中继续加入5’端带有荧光标记的M13正向引物(2μmol?
L-1)1.8μL,10xPCRbuffer(不含Mg2+)0.1μL,Tag酶(5U?
μL-1)0.08μL,ddH2O0.12μL。
2)PCR反应程序94℃5min,94℃30s,53℃30s,72℃30s,16个循环,72℃10min,4℃保存待用。
1.2.4 扩增产物纯化 毛细管电泳对DNA的纯度要求非常严格,必须对扩增产物进行纯化,尽量去净残留的盐分、蛋白质,残留的去污剂(SDS等)及残留RNA。
1.2.5 扩增产物的自动荧光检测
在96孔板的每个孔中分别加1μL纯化的PCR产物,8.5μL甲酰胺(含0.17%的分子内标),离心,然后95℃变性5min,置冰上10min,用ABl3730进行自动荧光检测。
1.2.6 数据分析 待电泳结束后,对样品的原始数据用GeneMapper3.0软件进行分析,获得不同样品扩增片段的长度,再利用PowerMarkerV3.25对供试材料进行遗传多样性分析。
2、结果与分析
2.1 TP-M13-SSR引物筛选及条件优化
对合成的24对TP-M13-SSR引物进行筛选,初步筛选出稳定性高、重复性好、PCR条件相对稳定的5对引物(引物名称及序列见表2)。
其中引物CH01f03b为苹果引物,其余为梨引物。
其PCR条件经优化后,用于25份材料的遗传多样性研究。
2.2 TP-M13-SSR的品种鉴定和遗传多样性检测
利用筛选出的5对引物对25份梨品种材料进行扩增,准确获得不同材料在不同位点的等位基因片段大小(图1),共72个等位基因。
利用NH013a和NH007b2对引物即可区分所有供试品种,区分率均为76%。
NH008b的区分率最高为80%,5对引物的区分率平均为76%。
5个SSR位点所揭示出的25份梨品种材料的遗传多样性(基因多样性)的变化范同为0.8192-0.8992,多态性信息含量的变化范围为0.8010-0.8909;2者中,最高的均是KAl6,最低的均是NH008b,平均值分别为0.8603和0.8474:
位点杂合度的变化范围为0.6800-1.0000(表3)。
25份种质材料在位点NH008b的遗传多样性水平偏离平衡的程度最高,而在位点KAl6的偏离程度最低。
其中,在供试的5个种中,新疆梨的遗传多样性水平和多态性信息含量最低,平均值分别为0.7160和0.6812;秋子梨的遗传多样性水平和多态性信息含量最高,平均值分别为0.7720和0.7379(表4,5)。
3、讨论
3.1 TP-M13-SSR在梨种质资源鉴定和遗传多样性研究中的应用
应用TP-M13-SSR技术可以准确区分所有的供试品种,效率高,准确性好。
供试材料虽然少,但包含了5个不同种。
足以充分证明此方法可以对梨不同种的遗传多样性水平进行研究,明确不同种的遗传多样性水平的差异。
TP-M13-SSR检测技术的完善以及在梨种质资源遗传多样性研究中的应用,为在低成本的基础上对其试验材料进行高通量的分析提供一种高效的研究手段。
3.2 TP-M13-SSR自动荧光检测技术的优缺点
李莉等在水稻上比较了高密度琼脂糖凝胶电泳、放射性32P标记的聚丙烯凝胶电泳以及自动荧光测序系统,郝晨阳等在小麦上详细地分析比较了常规的SSR荧光标记分析技术和银染技术,他们均得出SSR荧光标记分析技术能够区别仅为2bp之差的差异片段,具有更高的灵敏性、更经济、数据收集和处理效率高、数据更准确等优点,更适于进行遗传多样性的分析和研究。
TP-M13自动荧光检测技术较常规荧光SSR技术可以进一步的降低成本,因为TP-M13自动荧光检测系统只需要标记1条引物,而这条引物在对不同SSR标记进行检测的时候均可用,这要比荧光标记SSR引物要廉价的多。
因此,2000年M.Schuelke把这种方法形象的比喻为“穷人的方法”。
TP-M13自动荧光检测技术在基因组约为1.0Gbp的梨种质资源遗传多样性研究中的成功应用,再一次地验证了前人的结论,使机器自动收集、分析数据代替了银染方法的人工读取胶板的繁琐工作,在很大程度上降低了系统误差,提高梨种质资源遗传多样性研究的效率。
这也说明果树分子标记技术也正向着简便、快捷、实用、低成本、高通量、智能化的方向发展。
但是,科研工作者在采用该项技术时就要重点考虑分析样品的数量问题,当利用数量很多的SSR标记引物对梨的若干材料进行遗传多样性研究时,使用TP-M13自动荧光检测系统将会是非常经济、准确、高效的检测方法。
同时,对其他基因组较大的种质在进行遗传多样性研究时,也可以尝试使用TP-M13自动荧光检测系统。
但是,在分析的材料和位点很少时,银染法不失为一套经济有效的检测体系,因为普通引物的合成比荧光标记引物的合成周期要短、成本低廉,而且适宜长期保存和利用,而后者保存时间则相对较短。
通常,在利用普通荧光检测系统时,可以在同一PCR反应中同时进行多个SSR标记的扩增组合,利用不同标记之间扩增片段大小的差异以及荧光标记的颜色来进行检测和读取数据。
但是,在TP-M13自动荧光检测系统中,却比较困难,最多同时进行2~3个差异较大的SSR标记。
而且,由于体系中所采用的TP-M13引物与正常的SSR正向引物序列长度之间的差别,必须再依据峰图的高低,不断优化PCR扩增体系,主要是通过调整模板DNA和荧光引物的用量,以及第1次PCR反应的退火温度,摸索出低成本、高通量、杂带少的反应体系。
3.3苹果引物在梨遗传多样性研究中的应用
引物量少是梨种质资源遗传多样性研究的重要限制因素之一,因此Yamamoto等、易芍文等、姚利华等均将苹果上开发的引物应用到梨种质资源的亲本鉴定、亲缘关系等的研究中,并且获得与苹果扩增片段大小相近似的产物。
此次试验中筛选使用的苹果引物多态性好、稳定性高,能够揭示供试梨种质资源的遗传多样性水平,适宜于梨种质资源的遗传多样性研究。
因此,苹果引物可以广泛的应用到梨种质资源的遗传多样性研究中,以弥补梨引物量的不足。
但是,并非所有的苹果引物均适用,此次选用的1对苹果引物即是从24对苹果引物中筛选出来的。
须对苹果引物经过严格的筛选和反应条件的优化后,方可应用到梨种质资源遗传多样性的研究中。
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- TPM13SSR 技术 遗传 多样性 研究 中的 应用