拮抗菌gzf2固态发酵产孢条件的筛选及优化 学位论文.docx
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拮抗菌gzf2固态发酵产孢条件的筛选及优化学位论文
本科毕业论文(设计)
论文(设计)题目:
拮抗菌Gzf-2固态发酵产孢条件的
筛选及优化
贵州大学本科毕业论文(设计)
诚信责任书
本人郑重声明:
本人所呈交的毕业论文(设计),是在导师的指导下独立进行研究所完成。
毕业论文(设计)中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等,均已明确注明出处。
特此声明。
论文(设计)作者签名:
日期:
目录
摘要.......................................................................................................................................
Abstract...............................................................................................................................
第1章前言........................................................................................................................
1木霉的概述............................................................................................................
2木霉发酵的影响因素...............................................................................................
3我国木霉发酵的研究状况........................................................................................
4研究的目的及意义...................................................................................................
第二章材料与方法.............................................................................................................
1实验材料.................................................................................................................
1.1实验菌株..................................................................................................
1.2实验试剂..................................................................................................
1.3实验器材..................................................................................................
1.4培养基...................................................................................................
2实验方法......................................................................................................
2.1菌株的活化...............................................................................................
2.2孢子悬浮液的制备........................................................................................
2.3产孢量的测定方法........................................................................................
2.4单因素条件的优化.....................................................................................
2.4.1温度的筛选....................................................................................
2.4.2接种量的筛选..................................................................................
2.4.3pH值的筛选....................................................................................
2.4.4碳源的筛选...................................................................................
2.4.5氮源的筛选.....................................................................................
2.4.6其他添加量的筛选..........................................................................
2.4.7光照的筛选.....................................................................................
2.4.8搅拌的筛选....................................................................................
第3章结果与分析...............................................................................................................
1单因素优化结果.......................................................................................................
1.1温度对绿色木霉产孢量的影响......................................................................
1.2接种量对绿色木霉产孢量的影响...................................................................
1.3pH值的筛选对绿色木霉产孢量的影响..........................................................
1.4碳源对绿色木霉产孢量的影响........................................................................
1.5氮源对绿色木霉产孢量的影响........................................................................
1.6其他添加量对绿色木霉产孢量的影响........................................................
1.7光照对绿色木霉产孢量的影响.......................................................................
1.8搅拌对绿色木霉产孢量的影响.......................................................................
2Plackett-Burman(PB)试验
3最陡爬坡试验
4中心复合试验
4.1中心复合试验结果
4.2二次回归模型的建立及检验
4.3响应曲面的拟合
4.4最优条件的确定
5最优条件的验证试验
第四章小结与讨论....................................................................................................................
参考文献....................................................................................................................................
致谢...........................................................................................................................................
拮抗菌Gzf-2固态发酵产孢条件的
筛选及优化
摘要
本实验运用Minitab软件,将Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合,采用麸皮固态发酵,对绿色木霉Gzf-2菌株的产孢条件进行优化,结果表明,光照及搅拌对提高Gzf-2菌株产孢量有较大的显著效应。
优化后的培养条件为,在麸皮培养基的基础上,加入MgSO41.6‰、葡萄糖10%、(NH4)2SO41‰、CaCO31.6%、CaSO40.8%,每日光照12.17h,培养47.36h后进行搅拌,在此条件下,Gzf-2菌株产孢量达到5.93×109个/mL,比优化前提高了2.34倍。
关键词:
绿色木霉;固态发酵;Plackett-Burman试验设计;响应面分析法
ScreeningandoptimizationofantagonisticbacteriaGZF-2solid-statefermentationconditionsofsporulation
Abstract
Inthisstudy,theuseofMinitabsoftware,thePlackett-Burmanexperimentaldesignandresponsesurfaceanalysiscombinedbransolid-statefermentationofTrichodermavirideGzf-2strainssporulationconditionstooptimizetheresultsshowthatthelightandstirtoimproveGzf-2strainsporulationsignificanteffect.Optimizedcultureconditions,onthebasisofthebranmedium,addMgSO41.6‰,glucose10%,(NH4)2SO41‰,CaCO31.6%,CaSO40.8%dailyillumination12.17hculture47.36hstirring,inthiscondition,Gzf-2strainsporulationreached5.93×109/mLand2.34timeshigherthanbefore.
Keywords:
Trichodermaviride;solid-statefermentation;Plackett-Burmanexperimentaldesign;ResponseSurfaceMethodology.
第1章前言
1木霉(Trichodermaspp)的概述
木霉菌(Trichodermaspp)为丝状真菌,属于半知菌类,丝孢纲,丝孢目,丛梗孢科,它的有性阶段为子囊菌亚门,核菌纲,肉座目,肉座科的肉座菌属;广泛存在于植物叶面、根际种子、球茎和土壤等生态环境中。
木霉菌落生长速度很快,棉絮状或致密丛束状,菌落表面多数是绿色的,有一些是黄色的。
菌丝透明,有隔,分支多。
厚垣孢子有些有,有些无,间生或顶生,无色,壁光滑。
分生孢子梗是菌丝的短侧枝,分生孢子梗上对生或互生分支,分支上又可继续分支,形成二级和三级分支,分支角度成锐角或几乎成直角,分支的末端即为小梗。
分生孢子由小梗相继生出而靠黏液把它们聚集成球形的孢子头,分生孢子近球形或椭圆形,壁光滑或粗糙,透明或亮黄色。
木霉菌有很多种类,如绿色木霉(T.viride)、钩状木霉(T.hamatum)、康氏木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzinum)长枝木霉(T.longibrachiatum)、深绿木霉(T.atroviride)、顶孢木霉(T.fertile)[1]等。
绿色木霉(T.viride)菌株在PDA平板上生长快速,初期菌丝成白色致密的基质菌丝,;4d左右菌丝成蜘蛛网状的气生菌丝,绿色,菌落反面为无色,产生大量孢子,孢子为厚垣孢子。
菌丝透明,壁光滑,有隔,分枝多;厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短侧枝上,多数为球形,极少数为椭圆形,瓶梗对生或轮生,次级分枝多,3-5个轮生,基部收缩,中间膨大,终极瓶梗不收缩,基部延长。
孢壁具有明显的小疣状突起,在显微镜下单个孢子为淡绿色。
木霉菌的适应性强,生长迅速,能产生大量的孢子和抑菌代谢产物,在植物病原真菌如烟草黑胫病菌、镰刀菌、链格孢菌、丝核菌、毛盘菌、轮枝孢菌、腐霉菌、肉座壳菌等病害的生物防治中有广泛的研究,是世界公认的高效生防菌株。
木霉是一种重寄生真菌,其菌丝与寄主的菌丝平行、趋向生长、识别、接触、缠绕、附着、插入寄主菌丝内等方式进行寄生,直接从寄主菌丝体内吸取营养物质,从而影响寄主的生长与发育。
木霉在寄生过程中还分泌产生一些抑菌代谢产物和细胞壁降解酶类,如木霉素、抗菌肽、绿胶霉素、胶毒素、绿毛菌醇、绿粘帚霉毒素、绿毛霉素及孢壁降解酶(纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶等)等抑制其他病原菌的生长,以达到防治的目的。
2木霉发酵的影响因素
2.1碳源
木霉利用碳源能力很强,不仅能够利用葡萄糖、蔗糖,而且对多糖(纤维素、半纤维素)和相关多聚物(如几丁质)有较强的降解能力。
不同碳源物质对木霉的生长及产孢有一定的影响,多数木霉对葡萄糖的利用率较高;有研究发现,不同碳源物质还影响木霉的生物防治效果。
2.2氮源
木霉可以利用简单和复杂的氮源,如铵盐、硝酸盐、蛋白胨、氨基酸等。
在有碳水化合物作碳源的培养基中,木霉优先利用铵盐类。
氮源能促进菌丝生长,在提高木霉产孢量的发酵培养基中应控制其氮源用量,不能过多。
2.3矿质元素
多数木霉可以利用无机磷酸盐和硫酸盐作为磷和硫的来源,还有一些矿质元素对木霉的营养生长和产孢也产生影响,如K、Ca、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo等。
2.4生长因子和维生素
生长因子和维生素对于大多数野生型木霉不是必须营养成分,但生物素和维生素B1能够促进木霉的生长。
2.5二氧化碳和氧气
木霉是专性需氧菌,氧气的供应及线粒体的活性对纤维素酶的产生有一定的影响,低于最适氧分压的条件有利于纤维素酶的产生。
二氧化碳会影响木霉的生长和产孢,二氧化碳分压的升高能促进木霉菌丝的生长。
2.6其他因素
接种量、pH值、初始含水量、培养温度、光照、培养时间等因素对木霉的生长和产孢也有极大的影响,在进行发酵试验的过程中应考虑到这些因素的影响。
3我国木霉发酵的研究状况
孙斐[2]等以麸皮和玉米芯为固态发酵培养基主要的原料,筛选拟康氏木霉SDTP1菌株的最大产孢量。
采用单因素试验法,对麸皮与玉米芯的比例,培养基含水量,接种量,其他添加剂进行筛选优化。
结果表明,麸皮与玉米芯按8:
2,含水量为55%-60%,加入0.1%KNO3,1%CaSO4,1%蔗糖,接种量为10%;在28℃,以3m/s速度通无菌空气的发酵条件下培养120h,其产孢量达到1×109以上。
他们还采用浅盘式固态发酵在优化的单因素条件下模拟大规模发酵过程,结果表明,每克发酵产物产孢量达到1.34×109个。
夏斯琴[3]等以绿色木霉T4为菌株,以麸皮作为固态发酵基质,通过单因素试验和正交试验,研究碳源、氮源、初始接种量、培养温度及初始含水量及微量元素对该菌株产孢的影响。
结果表明,在麸皮培养基的基础上,加入10%葡萄糖,1‰(NH4)2SO4,2‰KH2PO4,4‰MgSO4,6‰CaCO3,初始接种量1×105个.(g干基质)-1,初始含水量60%,28℃发酵培养7d,产孢量达到4.47×1010个.(g干基质)-1。
肖龙龙[4]等对绿色木霉的发酵条件进行筛选,以察氏培养基为基础培养基,对其碳源、氮源、生物激活剂、培养温度、发酵时间进行筛选。
结果表明,加入3‰硝酸钠,1%蔗糖,2‰生物激活剂,在30℃下培养4d,该绿色木霉的产孢量较高。
刘霞[5]等研究不同发酵条件对绿色木霉抑菌的效果的影响,考察了不同碳源、氮源、初始pH值、接种量、装样量、发酵天数等因素。
结果表明,最适发酵条件为:
3%葡萄糖,0.2%(NH4)2SO4,初始pH为6,接种量为6%,装样量为60mL/250mL,发酵5d,在此条件下其抑菌效果最佳。
申屠旭萍[6]等在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman试验设计与响应面分析法,对哈茨木霉生产木霉素的发酵条件进行优化。
结果表明,葡萄糖浓度42.8g/L,牛肉膏15g/L,蛋白胨50g/L,MnCl0.5g/L,NH4Cl0.1g/L,接种量1.39mL,发酵时间102.88h,pH6.0,温度28℃,转速180r/min,在该发酵条件下,木霉素的产量可达147.44mg/L。
黄雪莲[7]等采用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化,在前期试验的基础上,对葡萄糖、丙氨酸、磷酸二氢钾3个显著因素的添加量进行中心组合试验,通过试验建立二次回归方程,运用软件对试验数据进行处理和分析,应用响应面分析法进行优化。
结果表明,葡萄糖、丙氨酸、磷酸二氢钾三者添加量分别为2.11g/dL、0.15g/dL、0.30g/dL时,绿色木霉菌菌落直径达到78.00mm,与预测值77.87mm较接近。
李淑瑞[8]等对绿色木霉液体培养基发酵产壳聚糖酶的培养基利用响应面方法进行优化试验,筛选得到了最佳产酶培养基组成:
麸皮0.5%、棉籽饼粉4.79%、Avicel2.56%、玉米芯1.03%、KH2PO40.2%、MgSO40.03%、(NH4)2SO40.2%、CaCl20.03%,pH自然,在此条件下,绿色木霉的最大产壳聚糖酶活为2.00IU/mL。
4研究的目的及意义
多数对木霉发酵的研究仅限于其单因子法和正交试验设计法进行培养基的优化。
单因素筛选只能考察一种因素的影响,而考察的因素间会存在交互作用,该方法并非总能筛选出最优条件。
正交试验注重如何合理安排试验,可以同时考察几种因素,寻找最佳因素水平组合,但不能以一个明确的函数表达式体现因素和响应值之间的关系,从而不能得到最佳试验优化条件[12]。
而运用Minitab软件,将Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合,对筛选出的单因素进一步优化。
在其他微生物发酵的优化中,已广泛运用PB试验和响应面法相结合进行发酵培养基的优化,得到了良好的效果。
麸皮是农副产品,来源丰富、价格低廉,且富含纤维素和半纤维素,是微生物生长的优良碳源。
以麸皮作为木霉发酵的基础培养基,大大降低了成本,产品干孢子形式存在,相对液体发酵,能长时间储存和运输,并具有较高的活力,作为固体制剂,在大田试验使用上比较方便。
因此,今后在木霉发酵中,以麸皮作为基础培养基,进行单因素试验筛选后,将Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合,对筛选出的单因素进一步优化,这一方法将得到广泛运用。
贵州省毕节烟叶产区烟草赤星病比较严重,绿色木霉对赤星病有较好的拮抗效果。
本实验室筛选出Gzf-2菌株对该烟区的赤星病有较好的拮抗作用;为了获得大量Gzf-2菌株的生防菌剂,本试验对其固态发酵产孢条件进行筛选。
经过单因素的筛选优化麸皮培养基,Gzf-2菌株的产孢量有所提高,但任然有提高的空间,试验通过Plackett-Burman试验设计与响应面分析法相结合对其进一步优化,得到了较好的效果。
绿色木霉对烟草赤星病的生物防治减少农药的使用,从而降低了对环境的污染和人体健康的危害;本试验为今后的大田试验生防菌剂的大量制备奠定基础。
第2章材料与方法
1实验材料
1.1实验菌株
实验所用菌株绿色木霉由微生物实验室从毕节地区烟地分离保藏,保种编号为Gzf-2。
1.2实验试剂
试剂名称产地
葡萄糖成都金山化学试剂有限公司
蔗糖成都金山化学试剂有限公司
淀粉天津市协和昊鹏色谱科技有限公司
(NH4)2SO4成都金山化学试剂有限公司
蛋白胨上海盛思生化科技有限公司
大豆蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司
KNO3成都金山化学试剂有限公司
NaNO3重庆茂业化学试剂有限公司
CaSO4成都科龙化工试剂厂
MgSO4重庆茂业化学试剂有限公司
CaCO3成都金山化学试剂有限公司
NaCl重庆川东化工(集团)有限责任公司
KCl重庆川东化工(集团)有限责任公司
1.3实验器材
仪器型号产地
高压灭菌锅LDZX—50KBS型上海申安医疗器械厂
光学显微镜ECLIPSEE100NIKON公司
超净工作台SW—CJ—IFD型蘇州净化有限公司
精密电子天平BS110S北京赛多利天平公司
电热恒温培养箱HH.B11.420上海跃进医疗器械厂
光照培养箱SPX-300B-G上海博讯实业有限公司
海尔冰箱BCD-215196TJ
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