超好研究生分子生物学课件-RNA干扰(2).ppt
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超好研究生分子生物学课件-RNA干扰(2).ppt
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,RNAi,一、RNA干扰(RNAinterference,RNAi)概念:
RNAi是指由短双链RNA诱发同源mRNA降解过程,是一种转录后基因沉默现象。
RNAi技术是在转录后水平抑制基因表达的一种研究基因功能的有力工具。
RNAi的发现源于两类研究:
一类是转基因植物的研究,二是反义的研究。
1990年由Napoli等领导的研究小组将基因转入牵牛花的实验中首次发现转录后基因沉默现象(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。
1998年,华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸大学医学院的CraigMello首次证实:
1995年SuGuo博士在利用反义阻断线虫par-1基因表达时出现的正义抑制基因表达的现象是由于污染微量双链而引起的,并将这种由双链引起特异性基因抑制现象称为干涉。
双链RNA(dsRNA)之所以能引起特异性基因抑制,是其激活细胞内一种称为icer的酶复合体所致icer是由核酸内切酶和解旋酶等构成,能识别异常双链RNA并将其切割成短dsRNA(21-23bp),后者可进一步与被激活的icer结合形成RNA诱导的沉默复合物形成(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)。
RISC是通过icer中的RNA解旋酶将双链RNA变成两个互补的单链RNA,然后单链RNA识别细胞内与其互补的靶RNA分子,并相互结合,这时icer中的核酸内切酶将RNA分子切断,使靶RNA分子失去编码蛋白质的功能。
RNAi一般分叁个阶段:
1.长双链RNA被细胞内的双链特异性核酸内切酶切成21-23bp短双链RNA,又称小干涉性RNA(smallinterferingNA,siRNA);.siRNA与细胞内某些酶和蛋白质等结合形成RISC.RISC识别与siRNA有同源性的mRNA,并在特定位点切割mRNA,二、MechanismofRNAi:
siRNA(shortinterferenceRNA)formationdsRNA21-25ntRNA(siRNA)siRNA的结构特征:
*5末端为磷酸基*3末端为羟基,并且有2个突出的单链核苷酸,Dicer,ATP,RDE-4,DCR-1,RNA诱导的沉默复合物形成(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)siRNAincorporatedintoRISCRDE-1(adaptor)RISCRISC:
ATP,RNA解旋酶(helicase),多种蛋白质,RNA-directedRNApolymerase(RdRP),siRNA核酸内切酶(Slicer),,识别和切割靶mRNARISCRISC+targetmRNAantisensesiRNA+targetmRNARISCcleavesthetargetmRNAintheregioncoveredbythesiRNA*RISC的siRNA有着高度的序列特异性,通过碱基配对定位到同源mRNA,RNA酶在siRNA-mRNA结合体3端12个碱基的位置切割mRNA.,dsRNAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIDicerRNAIII,ATPDCR-1,RDE-4siRNAIIIIIIIIproteins,ATP,RNAaseRDE-1otherfactorsRISCmRNAtargetrecognitionRISCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIImRNAcleavageRdRPIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIdegradedRNA,II,II,IIII,IIIII,IIII,IIII,IIII,AAAAAAA,7mG,IllustrationofthemechanismofRNAi1.Thestep(mRNAtargetrecognition)couldbeenvisionedtooccurintwoforms,eitherbyremovingoneofthestrandsofthesiRNAduplexfromRISCorbykeepingthetwosiRNAstrandsspatiallyseparated.2.AntisensesiRNArecognizesthetargetmRNA,andRISCcleavesthetargetmRNAintheregionofcoveredbyantisensesiRNA.3.AftertargetRNAcleavage,themRNAcleavageproductsarereleasedandRISCmaybereactivatedforanotherroundofcatalytictargetRNAcleavage.4.ThemRNAcleavageproductsmaybeusedfordsRNAsynthesisbytheRdRP.5.siRNAmaybeelongatedbyRdRP,andresultingdsRNAagainenterstheRNAipathway.,三、RNAi的特点1.RNAi具有高度的基因特异性*靶基因外显子同源的编码序列*两个基因在核苷酸水平上有80%同源,RNAi的阻抑作用可被共享。
2.靶向扩增*RdRP的参与,靶mRNA为模板,dsRNA形成3.转移RNAi指沉默信号沿着特定的基因移动*由于靶向扩增,siRNA可以和靶序列3端以外的其他部位结合*RISC引起染色体结构变化生成的异常mRNA4.高效性其作用效率比反义RNA还要高很多,四、RNAi的应用前景基因功能的研究利用RNAi技术研究特定基因功能的程序主要包括:
确定目的RNA并选择被干涉靶点;准备针对目的RNA的siRNA;用siRNA干涉目的RNA选择目的RNA干涉靶点时注意:
避开蛋白质结合位置,应在目的RNA的AUG下游50-100bp区的AA(19)TT或AA(21)序列;GC含量在50左右,长度在30nt左右,并与其它RNA无同源性按此原则设计的siRNA一般有5可能性具有特异性干涉作用。
、抗病毒治疗、抗肿瘤治疗,五、RNAi的基本功能、基因的表达调控目前研究发现,RNAi在转录水平的调控机制就有三种,一是通过NA甲基化调控基因表达;二是RNAi介导的异染色质的形成,现认为异染色质为细胞内的非转录活性区,并发现它的形成与RNAi密切相关而成为研究热点;三是RNAi可诱导消除,此现象目前仅在四膜虫研究中发现,它有别于前面两种只改变基因组结构而不改变基因组序列的机制、转座元件和防止病毒入侵、染色质结构的修饰,三RNAi在翻译水平上的调节dsRNADicer/Argonaute复合物microRNA(miRNA,22nt)incorporatedintoRISC在RISC内miRNA识别并结合靶mRNA的3端非编译序列存在未匹配的核苷酸和G/U错配碱基激活翻译抑制子核糖体延伸受阻,翻译抑制,RNAi诱导基因组甲基化修饰及结构改变1.RISC可使与siRNA同源基因组位点甲基化,在转录水平影响基因的表达。
2.RISC可通过募集组蛋白乙酰化酶,抑制转录。
3.RISC可使染色体结构改变。
RISC是RNAi的关键平台:
*在不同情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能。
*RISC负责接受从Dicer加工来的小RNA,并用该小RNA作为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生。
1.siRNA引起靶mRNA降解时,核酸酶结合至RISC使其获得了内切酶活性。
2.miRNA介导的蛋白调节作用中,翻译抑制因子参与了RISC的形成,RISC则能阻止翻译的进程。
3.甲基化酶或染色体结构改建因子的参加,使RISC有了阻抑转录、修饰及改变染色体结构的功能。
体外合成siRNA双链复合体(depluxes)*根据靶mRNA序列设计。
*mRNA开放阅读框区域作为靶点。
*从启动子下游50-100个核苷酸。
*3端和5端非翻译区、启动子不作为作用靶点。
*siRNA正义链19个核苷酸序列与靶序列相同,3端有2个碱基突出,为UU或dTdT;反义链19个核苷酸序列与正义链互补,3端有2个碱基突出,为dTdT或UU。
*3端dTdT结构能稳定siRNA。
*3端UU结构利于siRNA介导的基因沉默。
AA-N19标准(设计siRNA)75碱基mRN靶点AUG-AANNNNNNNNNNNNNNNNN-5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNUU-33-UUXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5或5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNdTdT-33-dTdTXXXXXXXXXXXXXXXXX-5GC含量在30%-70%,不能达到要求,寻找下一个AA序列。
Qiagen公司siRNA设计原则*mRNA编码区选择21个或23个碱基序列,区域在:
50-100nt50-100ntAUG-NNNNNNNNNNNNNN-终止子*GC含量为45%-55%,避免出现3个以上的鸟嘌呤。
*优先选择AA起始序列。
*3端碱基突出为dTdT可大大降低RNA合成的成本。
*使用GenBank中的BLAST软件查对,确保靶序列的唯一性。
*mRNA二级结构对siRNA的作用没有明显的影响。
*一般设计2条以上不同序列的siRNA。
体外合成siRNA的不足之处*受到转染技术和效率的影响*体内表达短暂(7天后)载体介导的细胞内合成siRNA体外构建siRNA表达载体,将载体导入细胞内,通过载体的启动子诱导表达,在细胞内产生siRNA。
TheendogenousexpressionofsiRNAsfromintroducedDNAtemplatesovercomessomelimitationsofexogenoussiRNAdelivery,inparticularthetransientlossofphenotype.,+1+1U6promoterGN17CTTTTTU6promoterGN17CTTTTTsenseantisensepollll,hybridization5-GN17CU1-41-4UCN17G-5siRNAduplex*selecttargetsequence-AGN17C-*thesenseandantisensestrandsconstitutingthesiRNAduplexaretranscribedfromindividualpromoters*pollll:
RNApolymeraseIII*U6promoter:
U6siRNApromoter,250bp*TTTTT:
RNAtranscriptionisterminatedwhenpolIIIencountersarunoffourorfivethymidinesbyincorporationofonlysomeoftheencodeduridines*blank:
thespacerbetweenthesenseandantisenseexpressionelement*GN17C:
siRNAelements*+1:
the+1nucleotideoftheU6promoterisalwaysguanosine,HipromoterAN18-TT-loop-N18TTTTTpolIII5-AN18UUhairpinRNA1-4UN18processing5-AN18UUsiRNAduplex1-4UN18-5*selecttargetsequenceAAN18-,谢谢!
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