第05章 工具酶.docx
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第05章工具酶
第五章工具酶
基因工程技术中能用于DNA和RNA的合成、切割、连接和修饰的各种酶叫做工具酶。
包括限制性核酸内切酶、核酸酶、聚合酶、连接酶、激酶、磷酸酶等。
第一节限制性核酸内切酶
(restrictionendonuclease)
一、细菌的限制一修饰现象发现
(一)限制-修饰现象
细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上
切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其
自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而
得以保护,这种现象叫做限制-修饰现象。
(1)限制性:
细菌可以抵御新病毒的入侵,而
这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内
部可摧毁外源DNA的限制性核酸内切酶。
限制
性核酸内切酶:
识别并切割特异的双链DNA序
列的一种内切核酸酶。
(2)修饰性:
限制酶识别的这段序列在自身的
DNA中不会出现吗?
为什么不降解自身DNA分
子?
研究发现甲基化酶与系统中的限制酶识别
相同的DNA位点,但使位点中的腺嘌呤A成
为N6甲基-腺膘呤,胞嘧啶C成为C5-甲
基胞嘧啶。
限制酶不能识别甲基化了的位点,
所以不能切割自身DNA分子。
甲基化酶有种
属特异性,只能修饰自身的DNA分子。
(二)限制酶的发现
●1962年,阿伯(Arber)就发现大肠杆菌对外来侵入的DNA有限制作用,预言了DNA限制性内切酶的存在。
●1968年,首次从E.coliK中分离到限制酶,它有特定的识别位点但没有特定的切割位点,其中切割位点离识别位点达1000bp以上;
●1970年,美国约翰·霍布金斯大学的H.Smith于偶然中发现,流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)能迅速降解外源的噬菌体DNA,其细胞提取液可降解E.coliDNA,但不能降解自身DNA,从而找到HindⅡ限制性内切酶。
(三)限制性核酸内切酶的分类
类型
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
蛋白质结构
3种不同亚基
单一成分
两种不用的亚基
切割反应辅助因子
ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸
Mg2+
ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸
特异性识别位点
无规律,如EcoK:
AACN5GTGC
回文结构
无规律,如EcoP15:
CAGCAG
切割位点
距识别位点至少1kbp随机切割
识别位点内
距识别位点3’端24-26bp处
在DNA克隆中的作用
无用
十分有用
很少采用
二、限制性内切酶的命名
Genus
(属)
Species
(种)
Strain
(菌株)
限制酶名称
Escherichia
Coli
R
EcoRI
Haemophilus
influeuzae
Rd
HindIII
三、限制性内切酶的识别特点
1.大多数识别序列是很严格的,只有少数有变动的余地。
如:
EcoRⅠ识别GAATTC,而HindⅡ识别GTPyPuAC
2.识别序列的碱基数一般为4—8个碱基对。
3.大多数识别位点具有180度旋转对称性,即回文结构(Palindromic)。
限制性内切酶识别序列出现的理论概率
1.原则上识别核苷酸序列为N个,则出现的概率为1/4N。
如,Sau3A的识别序列是GATC,出现的几率是1/256。
NotI识别序列是GCGGCCGC,间隔65536个核苷酸才有一次机会出现这个识别序列。
2.稀有酶(rarecuttingenzymes)是在目标基因组中切割位点较少的酶。
如富含AT(GC)的识别序列在富含AT(GC)的DNA分子中出现的概率高。
如,NotⅠGCGGCCGC,SspⅠAATATT
3.同裂酶(isoschizomer):
来源不同,但是具有相同的识别序列。
如,BamHⅠ和BstⅠ识别的序列都是GGATCC
四、限制性内切酶的切割方式
1.在对称轴5’侧切割产生5’粘端
2.在对称轴3’侧切割产生3’粘端
3.在对称轴处切割产生平端
五、识别位点与切割方式之间的关系
1.识别顺序不同,切割方式也不同;
2.识别顺序不同,切割产生的粘末端相同(同尾酶),如
3.识别顺序相同,切割方式不同;
4.相同的识别顺序,切割方式也相同。
六、限制酶产生末端的连接
1.匹配末端:
用同一种酶酶切;不同酶切。
2.平端:
可以直接连接,但效率低。
3.不匹配粘端:
不配对粘端的连接可采用两种方法:
(1)用核酸酶S1切除突出的核苷酸,将粘端修平,再用连接酶连接;
(2)用Klenow酶将粘端部分补平,再用连接酶连接。
Hung和Wensik(1984)发现以下几种情况也可以连接:
①仅为1个核苷酸且互补;②2个核苷酸且互补或在其中一个位置上带有错配(如dA:
dC);③3个核苷酸,并在中央位置有一错配(如dT:
dC)。
七、内切酶反应的因素
1.温度:
一般37C,有例外,如:
BamHⅠ30C,SmaI25C,TaqⅠ65C;
2.缓冲液:
高、中、低盐之分(NaCl),pH值;
缓冲液
NaCl0,50,100mmol/L离子强度
Tris-HClpH7.5-8.0
MgCl2激活因子
DTT保护还原性基因
3.时间:
1小时以上
4.反应体积和甘油浓度:
酶1/10体积
5.DNA纯度与构型
(1)纯度:
RNA,蛋白,氯仿,SDS,EDTA,EB,酚,乙醇,硫酸根,DNA
(2)构型:
切超螺旋需更多的酶
例:
lgDNA,用EcoRI切,1U
超螺旋pUCl9,EcoRI2.5U
酶单位的定义:
1U:
50ul反应体积中,1小时内酶完全切割1ugDNA所需要的酶量
近末端的切割:
eg:
AccIGGTCGACC 切不动
CGGTCGACCG切不动
CCGGTCGACCGG切不动
eg:
EcoRIGGAATTCCCGGAATTCCG2小时内90%完全酶切
eg:
PmeIGTTTAAAC20小时,不能切
GGTTTAAACC20小时,25%切开
GGGTTTAAACCC20小时,50%切开
AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG20小时90%切开
1.限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求,在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸,否则限制酶将难以发挥切割活性。
2.在设计PCR引物时一定要注意的地方,引物中酶切位点的上游一定要加入至少4bp的保护性碱基。
八、星号反应(StarActivity)——识别专一性下降
定义:
在某些反应条件发生改变时,限制酶识别序列的特异性可能发生改变,结果一种内切酶酶切同一片段会产生新的酶切位点,得到不同的酶切片段,这就是内切酶的星号活性。
原因:
1.甘油浓度过高
2.离子强度不合适
3.阳离子变化
4.pH变化
5.有机溶剂残留
九、限制酶在基因工程中的应用
1.DNA重组
3.构建新质粒;
4.DNA分子杂交;
5.制备DNA放射性探针;
6.绘制DNA物理图谱(限制酶识别序列分布图);
7.DNA序列分析;
8.DNA甲基化碱基的识别与切割;
9.基因定位及DNA同源性研究。
十、实验中如何进行限制性酶切
(一)单酶切
1.体系10-100μl
2.DNA≤50ng/μl
3.指定缓冲液
4.E≤1/10总体积
5.灭菌水补足
6.混匀,酶的最适反应温度下切2小时以上,检测酶切效果。
例子
BamHIbufferK10μl
n10XBufferK1μl
nDNA5μl
nBamHI0.5μl
n无菌水3.5μl
(二)双酶切
实验室常用的限制酶几乎都是TAKARA(宝生物)生产,提供了一些能共用缓冲体系的酶。
确定有共用缓冲体系,最好再看一下每个酶在这个缓冲液中的活力情况。
反应体系(10μl)
1.10×buffer1μl
2.DNA5μl
3.RE10.5μl
4.RE20.5μl
5.无菌水3μl
6.37℃,4h以上。
如果酶切后的产物要回收,则在酶切过程中可先电泳检测一下是否酶切完全。
如果不能同时酶切,就只能分开切
1.先选择一个酶切,4个小时以上,如果是环形DNA,要电泳检测是否切完全;
2.2倍体积乙醇,0.1倍体积的3M的NaAc(pH5.4),沉淀DNA;
3.用第二个酶切;
4.用乙醇沉淀或试剂盒回收。
第二节其他工具酶
一、聚合酶
DNA的体外合成需要DNA聚合酶。
这些酶作用时需要模板,合成的产物与模板互补。
包括:
大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow片段、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、逆转录酶。
(一)E.ColiDNA聚合酶Ⅰ
活性:
(1)53DNA聚合酶活性
(2)35核酸外切酶活性
(3)53核酸外切酶活性,特有的
用途:
切口平移法标记DNA
(二)大肠杆菌聚合酶Ⅰ大片段(Klenow酶)
活性:
(1)53聚合酶活性
(2)35外切核酸酶活性
用途:
(1)补平3凹端;
(2)3凹端标记;平末端标记
(3)合成cDNA第二链;
(4)Sanger双脱氧法进行序列分析;
(5)定点突变。
(三)T4噬菌体DNA聚合酶
活性:
(1)与Klenow酶相似;
(2)35外切核酸酶活性比Klenow酶强200倍。
用途:
(1)与Klenow酶相同;
(2)3’突出端末端标记。
(四)T7噬菌体DNA聚合酶
活性:
(1)与Klenow酶相似;
(2)是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的。
用途:
(1)与T4噬菌体DNA聚合酶相似
(2)拷贝长段模板的引物延伸反应
(3)去除外切酶活性,修饰成测序酶
(五)Taq酶
耐热(75--80C)的DNA聚合酶,专用于PCR。
(六)逆转录酶:
:
依赖于RNA的DNA聚合酶
AMV(源于鸟成髓细胞瘤病毒)
Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒)
活性:
(1)53聚合酶活性
(2)RNaseH活性,Mo-MLV的活性较低,有利于合成较长的cDNA。
用途:
将mRNA反转录成cDNA
(七)末端转移酶
常用的末端转移酶是来自小牛胸腺,是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。
作用:
在二价阳离子存在下,催化dNTP加于DNA的3’羟基上,也可用于3’突出双链的加尾。
若dNTP为T或C,首选Co2+;为A或G,首选Mg2+。
用途:
载体或cDNA加同聚尾(<100nt)
二、连接酶
(一)T4噬菌体DNA连接酶(T4-DNALigase)
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌
用途:
1.连接双链DNA上的单链切口(Nick)
2.连接粘性末端
3.连接平末端
(二)DNA连接酶
1.来源于大肠杆菌
2.只连接粘性末端DNA。
3.需要辅因子NAD
连接反应要注意的问题
1.目的基因与载体的比例:
3倍左右;
2.连接酶的缓冲液要分装成小份,不能反复冻溶
反应体系和操作
1.体系一般10μl
2.载体和目的基因片段混合,加水至8.5μl
3.45℃加热5min,使重新退火的粘端解链
4.加1μl连接酶的缓冲液
5.0.5μl连接酶
6.16℃,4h或过夜。
三、T4多聚核苷酸激酶
作用:
催化ATP的-磷酸基到DNA或RNA的5’-OH
用途:
1.用同位素标记DNA片段的5’-末端
2.化学合成片段的5’-OH上加磷酸基。
四、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)
作用:
去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5’磷酸根。
用途:
1.一般的用途是用这种酶处理DNA或RNA后,在5’端上标记32P。
2.经限制性内切酶酶切DNA片段后,用碱性磷酸酶处理可以阻止酶切的片段自身连接。
五、核酸酶
(一)DNA酶
作用:
为DNA内切核酸酶,水解单链或双链
用途:
(1)缺口平移标记探针时产生随机切口
(2)降解DNA
(二)RNA酶
作用:
内切核糖核酸酶,专用降解RNA
用途:
(1)质粒提取时降解RNA
(2)从DNA-RNA杂交体中去除未杂交的RNA
(三)S1核酸酶——外切核酸酶
作用:
(1)降解单链DNA或RNA(酶量小)
(2)降解双链DNA(酶量大)
用途:
(1)去除DNA突出端,切为平头
(2)打开cDNA发夹结构
(四)绿豆核酸酶——外切核酸酶
作用:
降解单链DNA;物理及催化性质与S1核酸酶相似;但作用比S1核酸酶更温和。
用途:
将DNA突出端变为平末端。
(五)核酸酶H(RNaseH)
1.核糖核酸酶H是内切酶,特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键,产生带有3’-OH和5’磷酸末端的产物,不降解单链核酸、dsDNA。
2.用途:
主要用于反转录合成第一条cDNA后去除RNA。
重点
1.限制修饰现象的定义、本质;
2.限制性内切酶的定义;
3.限制性内切酶的识别特点;
4.限制性内切酶识别序列出现的理论概率;
5.同裂酶和同尾酶的定义;
6.影响限制性内切酶反应的因素;
7.星号活性及其影响因素;
8.掌握DNA聚合酶的作用特点及主要应用;
9.掌握DNA连接酶的类型、特点和应用;
10.掌握T4核苷酸激酶和碱性磷酸酶的作用特点和主要应用。
解桂秋编
问师西来意排
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