专题课题申请书 紫杉烷类抗肿瘤药物及其中间体的生物催化合成Word文档格式.docx
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专题课题申请书 紫杉烷类抗肿瘤药物及其中间体的生物催化合成Word文档格式.docx
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姓名
承担课题名称
课题经费数(万元)
课题开始时间
课题结束时间
所属科技计划
工业化规模培养人参,西洋参生物技术及次生代谢调控研究
15
2006-10-1
2009-9-30
国家科技攻关计划
杨金玲
紫杉烯合酶基因重组载体的构建及其在真菌中的表达
14
2000-1-1
2002-12-31
新型紫杉烷类肿瘤多药耐药逆转剂的结构优化及药理学评价
24
2006-1-1
2008-12-31
其他说明事项:
新紫杉烷类化合物进行结构改造,其中包括了大量的生物转化方面的研究工作,既有催化体系的筛选,又有关键生物转化反应工艺的优化等工作,并通过药理活性评价获得了1个生产路线短、得率高、活性强、毒性低的肿瘤多药耐药逆转剂(NPB-014,已申请专利)。
这些工作可为此课题中涉及的有关生物转化方面的研究提供大量丰富的经验及一些设备上的基本保证,为本项目的实施奠定了坚实的基础;
2、在紫杉醇类似物的生物转化研究工作中,通过与桂林晖昂生化药业有限责任公司3年多的合作,建立了高通量筛选方法,获得了3株能选择性水解(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇木糖基的细菌,并进行了初步的生物转化工艺优化、相关酶基因的克隆与表达等研究工作。
上述目的微生物均为首次发现具有此功能,并且有2株微生物为新菌种。
课题组长及课题组主要成员是否曾就相同或类似课题863计划和国家其他科技计划提出申请(如有,请说明申请人姓名、申请科技计划名称、申请课题名称、申请时间、申请结果等情况,并说明与本课题申请的关系)
、课题简介(简要说明课题的目的意义、主要研究内容、预期目标等,字数要求1000字以内)
肿瘤是全世界死亡率最高的重大恶性疾病之一,而且在治疗过程中常常伴随着多药耐药性,造成最终化疗的失败。
解决治疗肿瘤有效药物的资源问题从而使更多的肿瘤患者得到有效治疗是控制其死亡率的有效途径之一,如抗肿瘤药物紫杉醇,其资源有限,价格昂贵,仍不能普及到广大肿瘤患者,故寻找新的紫杉醇生产途径是目前国际上关注的热点之一;
另外,临床上肿瘤化疗最大的障碍在于肿瘤多药耐药性(multidrugresistance,MDR),克服肿瘤MDR一直是肿瘤化疗中的一个难点,其中寻找具有逆转活性强、低毒的肿瘤MDR逆转剂是这一领域研究的热点之一。
化合物NPB-014具有显着的体内外肿瘤MDR逆转活性,约为阳性对照药verapamil活性的2倍,且毒性较小。
其作用机理主要是通过抑制癌细胞膜蛋白P-gp对抗肿瘤药物的外排作用,增加抗肿瘤药物在癌细胞内的蓄积从而抑制癌细胞的增殖。
因而,NPB-014是一个具有全新结构、理想的肿瘤MDR逆转剂的候选药物,有望开发为具有自主知识产权、理想的新型肿瘤MDR逆转剂。
化合物NPB-014是通过银杏培养细胞特异性9alpha位羟基化后经一步简单酯化反应而得。
前期研究结果显示NPB-014的关键中间体—9alpha-OHsinenxanA的规模化生产是制约此项研究进一步深入研究的瓶颈。
紫杉醇是目前一类临床上用于治疗晚期卵巢癌、乳腺癌的最好药物之一,另外还发现它们对非小细胞肺癌、前列腺癌等也具有良好的疗效,需求量越来越大,其资源匮乏问题仍为全世界医药研究与工业界关注的热点。
在紫杉醇的提取与分离过程中紫杉醇类似物如(10-去乙酰)-7-木糖紫杉醇常作为副产品而废弃,并给分离纯化带来一些困难,造成极大的资源浪费与环境污染。
利用化学方法对这些紫杉醇类似物的结构改造从而获得紫杉醇已有报道,但存在选择性低、容易生成异构体、副产物多且反应步骤长、产率低、造成环境污染等问题,而通过生物催化手段将这些“废物”加以利用,可以克服化学方法的不足。
在可再生的红豆杉枝叶中的(10-去乙酰)-7-木糖紫杉醇含量较高(约为紫杉醇的10倍或更高),前期研究中我们通过大量筛选获得了能够将7-木糖基团进行高效选择性水解的微生物,进行了生物催化工艺的探索,但依然存在一些技术难题尚不能规模化生产。
综上所述,此课题拟利用新发现的新型全细胞催化剂对上述2个生物催化工艺进行优化,解决规模化生产问题。
此项研究立足于自主创新,对建立具有自主知识产权、成本低、可工业化生产的重要药物中间体的生物催化技术体系,填补国内空白,极具意义。
本课题的主要研究内容为:
1)肿瘤MDR逆转剂NPB-014关键中间体的生物催化合成,进行银杏细胞对来源于红豆杉培养细胞的紫杉烷类化合物sinenxans的9a特异性羟基化反应的工艺优化研究;
以及2)抗肿瘤药物紫杉醇及其中间体的生物催化合成,利用高通量筛选方法,通过诱变或相关酶基因改造方法获得能高效进行(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇分子中7-木糖基团水解的菌株jh-21的变异株,并进行生物转化工艺优化;
明晰上述生物催化过程中关键因子,确定最佳生物催化工艺;
另外,3)进行2个生物转化反应中试试验,确定中试生产工艺及随后的提取、分离及化学合成目的化合物等后处理工艺。
本课题预期目标为:
获得能高效进行(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇分子中7-木糖基团的菌株jh-21的变异株,确定上述两个生物催化过程的最佳工艺并中试放大生产,使目标产物得率达500mg/L以上;
通过本项目的实施申请发明专利3-5项,培养博士、硕士研究生各5名以上,在国内外核心刊物上发表学术论文10-15篇。
一、课题主要研究技术的国内外发展现状与趋势:
1、利用银杏细胞进行肿瘤多药耐药逆转剂NPB-014中间体的生物催化合成
SinenxanA(已申请专利)是本室从红豆杉属植物愈伤组织及细胞培养细胞中分离得到的具有紫杉烷基本母核、结构新颖的化合物,在培养物中含量较高,一般为干重的2-3%,最高可达5-6%。
“新世纪优秀人才支持计划”基金及其他基金项目的资助下,进行了系统研究工作,包括红豆杉细胞培养、生物转化、化学结构改造、药理活性评价及机制探讨等,取得了一系列令人鼓舞的研究结果。
特别是发现银杏培养细胞能够对sinenxanA特异性9羟基化且产率较高(约为70%),并通过衍生化后筛选得到体内外均具有强逆转活性、低毒的先导化合物NPB-014,明确了其主要作用机制为抑制MDR肿瘤细胞过量表达的细胞膜蛋白p-gp对抗肿瘤药物的泵出功能,使抗肿瘤药物能在胞内累积从而杀死肿瘤细胞,即恢复肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。
这些研究国外尚无报道,属原始自主创新研究。
2、利用微生物进行抗肿瘤药物紫杉醇关键中间体的生物催化合成
关于利用微生物转化技术对红豆杉属植物可再生资源枝叶中含量丰富的的(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇进行生物酶促转化,直接大量生产具有重要药用价值的抗肿瘤药物紫杉醇或/和紫杉烷类药物重要中间体的研究,国外已有一些相关的报道,但均处于实验室的一种小规模摇瓶阶段的探索性研究,没有涉及到反应工艺的优化、菌种的选育、大规模(生物反应器)试验、固定化生物转化以及相关酶及其基因工程等方面的研究,远没有达到工业化生产的水平。
最新文献及专利检索表明:
国内尚无此方面研究的公开报道,也无公开的专利发表。
目前,优化生物转化反应过程,建立高选择性、高稳定性及高效性的生物转化体系,研究和建立固定化生物催化技术体系和全细胞催化体系,以及进行相关酶的分离、纯化与相关酶基因的克隆、表达从而获得更高效的工程生物转化菌株等是当前生物转化研究领域发展的趋势,本课题也拟从上述几方面来研究紫杉醇及其中间体的微生物催化合成进行研究,能够形成并拥有自主知识产权,具有创新性。
二、课题主要研究技术国内外专利授权情况
1、利用银杏细胞进行肿瘤多药耐药逆转剂NPB-014中间体的生物催化合成:
此部分工作均为原始创新研究,拥有自主知识产权。
首先,此研究所用的原料化合物sinenxanA已被授权获得国际专利[PCTInt.Appl.WO9406,740(Cl.C07C35/37),JPAppl.92/249,047],其次,肿瘤MDR逆转剂NPB-014及其中间体9-OHsinenxanA的制备、用途已获得专利保护(CN1393438A)。
2、利用微生物进行抗肿瘤药物紫杉醇关键中间体的生物催化合成:
也即(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇的7-木糖基团的微生物选择性水解。
此方面的工作已有授权的美国专利(USPatent,5700669)。
但:
(1)受专利保护的菌种为莫拉氏菌属(Moraxellasp),而我们筛选得到3株功能菌不属于此类微生物,为新发现的生物催化剂,不属上述专利保护范围,因此可申请菌种及其功能应用专利;
另外所涉及的生物转化工艺,相关酶基因的克隆、表达等研究工作也可申请专利并拥有自主知识产权。
课题主要研究内容、拟解决的技术难点和主要创新点,现有研究基础
3.3.1.主要研究内容
1)、进行银杏细胞对来源于红豆杉培养细胞的紫杉烷类化合物sinenxanA的9a特异性羟基化反应的工艺优化研究,包括培养基的优化、底物加入方式、固定化生物转化、两相生物转化以及生物反应器的选择等,明确关键过程因子,确定最佳转化工艺;
2)、利用高通量筛选方法,通过诱变或相关酶基因改造方法获得能高效进行(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇分子中7-木糖基团水解的菌株jh-21的变异株,并进行生物转化工艺优化,包括培养基优化、底物加入方式、固定化生物转化、两相生物转化以及生物反应器的选择等,明确关键过程因子,确定最佳转化工艺;
3)、进行生物转化中试试验,确定中试放大工艺及提取、分离及化学合成目的化合物等后处理工艺。
3.3.2.拟解决的技术难点
1)、前期研究结果显示:
银杏培养细胞对sinenxanA的转化率虽然较高,但大量获得此中间体仍然存在着较大的困难,主要原因在于:
①底物加入浓度低(60mg/L),②由于此反应为P450加单氧酶系介导的羟基化反应,合适的方法是采用全细胞作为生物催化剂,而现阶段主要采取分批发酵方式,造成银杏细胞利用率低,不能连续反复使用。
由此,本部分工作拟解决的技术难点为增加底物加入浓度以及银杏细胞连续使用问题;
2)、在利用微生物jh-21进行(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇分子中7-木糖基团特异性水解研究时发现:
由于①底物和产物都有较强的毒性,对细胞具有一定的杀伤作用,致使底物加入浓度低(约300mg/L),②所发现菌株jh-21为一种新菌株,最佳培养条件尚未确定,生长缓慢,酶活力较低;
致使反应周期较长,产物的最后产率较低(约100mg/L)。
由此,本部分工作拟解决的技术难点为增加底物加入浓度以及提高生物催化剂的生物量与酶活力。
3.3.3.主要创新点
1)、以本室生物合成的具有自主知识产权的新型紫杉烷为原料,采用酶化学法进行结构修饰获得的肿瘤MDR逆转剂NPB-014,并利用新型生物催化剂进行关键中间体的规模化生产,为具有新特点和自主知识产权的MDR肿瘤逆转剂的创制奠定基础,为原始自主创新研究;
2)、利用可拥有自主知识产权的微生物转化技术对红豆杉可再生资源枝叶中含量丰富的的(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇进行生物酶促转化,直接大量生产具有重要药用价值的抗肿瘤药物紫杉醇和/或重要中间体,合理利用资源,变废为宝,可解决其资源匮乏问题;
另外利用现代分子生物学技术对相关酶的基因进行克隆、转化,获得具有高转化能力的工程微生物,这是生物转化领域发展的前沿;
3)、生物催化合成重要药物或其中间体,其过程环境友好,符合目前全球可持续发展战略,此项研究可建立具有自主知识产权、成本低、可工业化生产的重要紫杉烷类抗肿瘤药物中间体的生物催化技术体系,填补国内在此研究领域的空白。
3.3.4.现有研究基础
1)、利用银杏细胞进行肿瘤多药耐药逆转剂NPB-014中间体的生物催化合成
近年来,对来源于红豆杉培养细胞的紫杉烷类化合物sinenxanA进行了系统的生物转化研究工作,取得了一系列的研究成果,研究工作得到了“教育部优秀人才支持计划”9a-OHsinenxanA在合成肿瘤多药耐药逆转剂NPB2006的关键作用,我们也进行了一些探索性研究,如明确了银杏细胞催化此羟基化反应是由P450加单氧酶系介导的(通过制备微粒体并进行反应、O18同位素标记实验确证的)、在生物转化过程中利用b-环糊精(底物:
b-环糊精=1:
1)能大大增加底物的加入浓度(从60mg/L增加到300mg/L),而转化率没有明显下降;
另外,利用海藻酸钠包埋银杏细胞进行固定化细胞生物转化试验,结果表明虽然转化率有所下降,但固定化细胞连续5批都保持了一定的催化能力。
另外,申请人在攻读博士学位期间,其学位论文题目为“银杏组织与细胞培养及其银杏内酯B产生的研究”,在银杏细胞培养研究工作方面已累计了大量的科学资料。
特别地,部分研究工作成果申请了多个专利[PCTInt.Appl.WO9406,740(Cl.C07C35/37),JPAppl.92/249,047;
CN1393438A],整理并发表了学术论文10多篇。
这些都为本项目的研究奠定了坚实的基础。
2)、利用微生物进行抗肿瘤药物紫杉醇关键中间体的生物催化合成
通过生物信息学设计了-木糖苷酶基因的上下游引物,并从基因组DNA中扩增得到了相关的基因,正进行表达及功能验证实验。
这些研究结果都为此项课题的研究工作打下了坚实的基础。
注:
申请的专利及发表的学术论文目录见附件;
通过微生物酶法水解获得的主要中间体—10-去乙酰紫杉醇的核磁共振波谱图也见附件(其它)。
课题预期达到的目标、主要技术指标,可获得专利等知识产权及人才培养情况
一、课题预期达到的目标
1、通过采用环糊精的加入、两相生物转化、固定化生物转化以及生物反应器的选择等手段优化银杏细胞对sinenxanA9羟基化反应工艺,解决底物添加浓度低、全细胞催化剂利用率低等问题,明确生物催化关键过程因子,确定最佳工艺并进行中试放大研究,以高效获得目标活性化合物NPB-014的关键中间体9a-OHsinenxanA及进一步化学制备NPB-014,供药理活性、作用机制以及毒理学等临床前研究;
2、利用高通量筛选方法,通过诱变或相关酶基因改造方法获得能高效进行(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇分子中7-木糖基团水解的菌株jh-21的变异株,并进行生物转化工艺优化,解决底物加入浓度低、微生物生长缓慢及酶活力低等问题,明确关键过程因子,确定最佳转化工艺并进行中试放大研究;
二、主要技术指标
明确银杏细胞对sinenxanA特异性9a羟基化反应的关键过程因子,确定最佳生物催化工艺,中试规模达100立升以上,产物得率达500mg/L;
通过诱变及现代分子生物学技术获得能高效进行(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇分子中7-木糖基团的菌株jh-21的变异株,明确关键过程因子,确定最佳生物催化工艺,中试规模达100立升以上,产物得率达500mg/L。
三、可获得专利等知识产权
1、可获得利用银杏细胞进行肿瘤MDR逆转剂NPB-014中间体的生物催化合成工艺方面的专利1-2项;
2、可获得能够进行选择性水解(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇分子中7-木糖基团的若干菌株与其变异体,及其功能的专利2-3项;
生物催化合成工艺方面的专利1-2项;
以及相关酶基因及其功能专利1-2项;
3、在国内外核心刊物上发表学术论文10-15篇。
四、人才培养情况
参加本项目的科技人员均为青年科研人员,既有在本领域取得一定成果的青年学术带头人,又有受到良好专业训练的青年科技骨干,他们年富力强,对科学研究怀着极强的热情,通过此项目可进一步:
1、培养在承担国家重大项目中专业基础扎实、亦具有较强组织协调能力的青年学术带头人1-2名;
2、锻炼在天然药物或其中间体生物催化合成领域具有坚实理论基础及丰富实际经验、精干的青年研究梯队,储备青年人才,用于将来承担国家相关重大研究、攻关任务等;
3、培养博士研究生3-5名,硕士研究生3-5名。
课题拟采取的研究方法,课题技术路线(或实施方案)及其可行性分析(如有协作单位,请说明课题的任务分工)
3.5.1.课题拟采取的研究方法及技术路线
本课题涉及的两个生物催化反应及后续的化学合成反应如图1、图2所示:
图1.肿瘤多药耐药逆转剂NPB-014的酶化学合成
图2.抗肿瘤药物紫杉醇的酶化学合成
上述两组反应中,由于所涉及的化学反应简短、便捷,方法成熟,收率高,故其关键步骤在于酶催化合成中间体,下面主要就此两个生物催化反应关键步骤阐述拟采取的研究方法及技术路线。
一、利用银杏细胞进行肿瘤多药耐药逆转剂NPB-014中间体的生物催化合成
前期研究结果表明:
针对这些难点,拟采用的研究方法及技术路线如下:
下述各方案中均采用已建立的HPLC方法测定底物消耗量和目标产物生成量对各工艺进行评价。
1)、环糊精的影响:
主要考察不同环糊精与底物的不同摩尔配比对增加底物加入浓度及转化率的影响,以及减小对细胞的毒性,确定合适的环糊精种类及与底物的最佳摩尔配比;
2)、液液两相生物转化:
首先在摇瓶水平考察不同疏水性有机溶剂[正己烷、环己烷、三十烷醇、液体石蜡、乙酸丁酯、辛烷等logP值较大的水互溶性差的有机溶剂]在液液两相生物转化中的作用,主要考察有机溶剂的加入比例及其有机溶剂对增加底物加入浓度及转化率、细胞毒性的的影响;
转化率可通过分离出有机溶剂的部分来进行测定,细胞毒性可通过测定培养细胞的生物量来进行评价选择1-2种一定比例的溶剂进行小型生物反应器(5L)生物转化试验;
3)、液固两相生物转化:
首先在摇瓶水平考察不同固体吸附剂(如各种树脂AberliteXAD-2,AberliteXAD-7,Dion101,等)在液固两相生物转化中的作用,主要考察对增加底物加入浓度及转化率的的影响;
转化率的测定可直接通过洗脱树脂来进行。
选择1-2种合适的吸附剂进行小型生物反应器(5L)生物转化试验;
4)、全细胞固定化生物转化:
主要采用不同载体对银杏培养细胞进行固定化,如采用凝胶(海藻酸盐、聚丙烯酰胺等)包埋法固定化,或采用微囊化法(多聚赖氨酸-海藻酸微囊化、海藻酸-壳聚糖-海藻酸微囊法,等),首先在摇瓶水平考察不同包埋法对生物转化效率的影响以及可连续被用来进行生物转化的能力;
通过每批次产物的得率及连续转化的能力对不同的包埋方法进行评价。
选择1-2种合适的细胞包埋法进行小型生物反应器(5L)生物转化试验;
5)、最适生物反应器类型的确定:
考察不同类型生物反应器(如气升式、搅拌式、膜生物反应器等)对此生物转化反应的影响,确定最适生物反应器类型;
6)、关键过程因子及最佳转化工艺的确定:
通过上述结果,组合各种最佳条件进行试验(有协同作用的整合在一起),确定关键过程因子,获得银杏全细胞水平下转化sinenxanA生成9a-OHsinenxanA的最佳工艺,并在摇瓶和小型生物反应器两水平下进行试验,并进行数次中试规模试验,最终获得最佳生物转化生产工艺。
二、利用微生物进行抗肿瘤药物紫杉醇关键中间体的生物催化合成
由于①底物和产物都有较强的毒性,对细胞具有一定的杀伤作用,致使底物加入浓度低(约300mg/L),②所发现菌株为一种新菌株,最佳培养条件尚未确定,生长缓慢,酶活力较低;
针对这些难点,拟采用的研究方法及技术路线如图3:
图3.微生物选择性水解(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇生产抗肿瘤药物紫杉醇及其中间体的研究方法及技术路线
具体为:
1)、产紫杉烷7-木糖苷酶微生物jh-21高效变异株的高通量筛选:
①通过传统方法如紫外线、60Co射线、甲酸磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍等物理和化学的方法对选定的能进行所需反应的微生物进行诱变,结合高通量筛选(以燕麦等木聚糖作为选择压力进行初筛,再用4-甲基-7-木糖-香豆素复筛-木糖水解可生成具荧光的产物)获得具有更高活力的突变体;
②利用生物信息学手段并采用现代分子生物学技术对相关转化酶基因进行克隆、转化,获得工程微生物,结合高通量筛选获得高效转化能力的工程菌株;
2)、实验室条件下的生物转化工艺的优化:
采用摇瓶及小型生物反应器,以各种形式的底物(单体、混合物、粗提物等),通过考察培养基的成分(碳源、氮源、金属离子等)、pH、温度、诱导剂、底物加入浓度及方式(如连续滴加、与环糊精形成包合物等)、反应动态、通气量,以及固定化细胞(以及粗酶)、干细胞、两相生物转化以及不同类型生物反应器等对生物转化得率影响等,确定各个反应的最佳转化工艺;
3)、中试试验:
根据上述研究结果采用适合的工艺对各种形式的底物(单体、混合物、粗提物)进行生物转化中试试验,确定最佳中试生产条件及后处理条件。
三、化学合成及后处理工艺确定
由上述2个生物催化反应得到的中间体经过化学合成生产NPB-014或紫杉醇所涉及的反应路线短(前者为1步,后者为2步,见图2),并且已有成熟的反应方法及工艺,在此基础上,进行中试规模的合成及后处理试验,确定规模化生产中的工艺。
3.5.2可行性分析
上述实验方案是在申请者及其同事、协作单位充分论证后确立的,每个实验步骤的实验方法均有成功的文献报道或已在申请者所在的实验室完成过,因此完全具有可行性。
近年来,对来源于红豆杉培养细胞的紫杉烷类化合物sinenxanA进行了系统的生物转化研究工作,取得了一系列的研究成果,研究工作得到了“教育部优秀人才支持计划”9a-OHsinenxanA在合成肿瘤MDR逆转剂NPB-014的关键作用,我们也进行了一些前期研究,取得了一定的结果(见研究基础)。
通过高通量筛选方法获得了能够选择性水解(10-去乙酰-)7-木糖紫杉醇木糖基的微生物jh-21,目前其转化率已可达到50%。
另外还通过生物信息学设计了-木糖苷酶基因的上下游引物,并从基因组DNA中扩增得到了相关的基因,验证了其功能。
这些前期研究工作为本课题相关生物转化酶基因的克隆、表达从而获得高效菌株等研究工作打下了基础,积累了丰富的经验。
申请者课题组所依托的单位中国医学科学院&
中国协和医科大学药物研究所,是国家重点药物研究机构之一,下设药物化学、天然药物化学、天然产物生物合成、国家药物及代谢产物分析研究中心等科室,学科齐全,设备精良(见)。
协作单位桂林晖昂生化药业有限责任公司(前身是中国科学院广西植物研究所制药厂),资金较为雄厚,主要从事纯植物提取产品的研制开发,目前的主导产品是紫杉烷类,能够提供实验所需的所有用于生物催化的底物及植物粗提物等,而且在前期工作中我们已经建立了良好的合作关系;
而且,在本课题的实施过程中,如若需要,公司拥有的人力、物力均可随时投入使用。
综上所述,本项目
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