高效液相色谱实验核心技术问题解答.docx
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高效液相色谱实验核心技术问题解答
1、高效液相色谱是如何实现高效、迅速、敏捷?
解:
气相色谱理论和技术上成就为液相色谱发展创造条件,从它高效、高速和高敏捷渡得到启发,采用5一10四微粒出定相以提高柱效,采用高压泵加快液体流动相流速;设计高敏捷度、死体积小紫外、荧光等检测器,提高检测敏捷度,克服典型液相色谱曲缺陷,从而达到高效、迅速、敏捷。
2、与气相色谱法相比高效液相色谱有哪些长处和局限性?
解:
气相色谱分析对象是在校温下具备一定挥发性、对热稳定购物质。
因而它只限于分析气体和沸点低化合物或挥发性衍生物。
而高效液相色谱由于以液体作为流动相,只要被分析物质在选用流动相中有一定按解度,便可以分析,因此合用性广,不受样品挥发性和热稳定性限制,特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差化合物,例如,生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差天然产物等。
在当前已知有机化台物中,
只有20%样品可不经化学解决而能满意地用气相色谱分离,80%有机化合物要用高效液相色谱分析。
气相色谱中流动相是惰性,它对组分没有作用力,仅起运载作用、而高效液相色谱流动相不但起运载作用,并且流动相对组分有一定亲合力,可以通过变化流动相种类和构成提高分离选取性,此外可作流动相化合物多,选取余地广。
与气相色谱相比,高效液相色谱另一种长处是样品回收比较容易,只要开口容器放在柱子末端,就可以很容易地将所分离各组分收集。
回收是定量,可以用来提纯和制备具备足够纯度单一物质。
高效液相色谱局限性是,日前检测器敏捷度不及气相色谱。
必要特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离影响。
3、试比较气相色谱与液相色谱H-u曲线,分析产生不同因素。
解:
从图可看出,气相色谱和液相色谱得到H-u曲线,形状迥然不同,流动相流速对柱效影响也不同样,在气相色谱H-u曲线上,塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一最低点,这时柱效最高,板高最小,流速最佳。
而液相色谱H-u曲线,未浮现流速减少板高增长现象,由于最佳流速趋近于零,普通观测不到最低板高相相应最佳流速。
在正常状况下,流速减少,板高H总是减少,这与气相色谱明显不同。
在气相色谱中流动相流速增大,柱效呈直线减少,而在液相色谱中,流动相流速增大,柱效平缓减少。
其重要因素是液相色谱流动相为液体,液相扩散系数Dm很小,普通仅为气相扩散系数104~105分之一,因此分子扩散项在低u时也不起多大作用、因而液相色谱H-u曲线未能浮现流速减少,板高增长现象。
到高速时,虽然柱内线速提高,但固定相和流动相传质都能不久进行,故H-u曲线上升缓慢。
4、简述液相色谱中引起色谱峰扩展重要因素,如何减少谙带扩张、提高柱效?
解:
液相色谱中引起色诺峰扩展重要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。
在液相色谱中要减小谱带扩张,提高柱效,要减少续料颗粒直径,减小境料孔穴深度,提高装填均匀性,采用低粘度溶剂作流动相,流速尽量低,同步要尽量采用死体积较小进样器、检测器、接头和传播管线等。
5、为什么要提出折合参数?
有何特点?
解:
咱们懂得色谱操作条件对板高是有影响.Giddings发现,固定相相似,填充良好,共是粒度dp不同,因而H-u曲线不同,在液相色谱中,培板高度是粒度函数,为了比较不向色谱条件下板高H.提出折合参数,涉及折合板高、折合流速、折合柱长。
其特点是对于不同粒度填料能得到相似H—ur曲线,因而可以在相似条件下比较不同填料柱效。
6、色谱柱A长度为15cm,载体粒度为5m.另一B柱长为30cm,载体粒度为10m,两柱柱效相等吗?
解:
A柱折合柱长为30000,B柱折合柱长也为30000,表白组分在两根柱内从柱人口到出口都通过30000个载体颗粒.两校柱效相等。
7、何谓梯度淋洗,合用于哪些样品分析?
与程序升温有什么不同?
解:
梯度淋洗就是在分离过程中.让流动相构成、极性、pH值等按‘定程序持续变化。
使样品中各组分能在最佳k下出峰。
使保存时间短、拥挤不堪、甚至重叠组分,保存时间过长而峰形扁平组分获得较好分离,特别适合样品中组分k值范畴很宽复杂样品分析。
梯度淋洗十分类似气相色谱程序升温,两者目相似。
不同是程序升温是通过程序变化柱温。
而液相色谱是通过变化流动相构成、极性、pH值来达到变化k目。
8、流动相为什么要预先脱气?
惯用脱气办法有哪几种?
解:
流动相中溶解气体存在如下几种方面害处,气泡进入检测器,引起光吸取成电信号变化,基线突然跳动,干扰检测;溶解在溶剂中气体进入色谱柱时,也许与流动相或固定相发生化学反映;溶解气体还会引起某些样品氧化降解.对分离和分析成果带来误差。
因而,使用前必要进行脱气解决。
惯用脱气法有如下几种:
(1)加热脱气法;
(2)抽吸脱气法;(3)吹氦脱气法;(4)超声波振荡脱气法。
9、按固定相孔径大小分类,液相色谱固定相有哪几类?
各有什么特性及合用范畴?
解:
从固定相孔隙深度考虑,液相色谱固定相分为表面多孔型(薄壳型)和全多孔型(全孔型)两类。
表面多孔型固定相多孔层厚度小.孔浅,相对死体积小,出峰迅速,柱效高,颗粒较大,渗入性好,由于孔浅,梯度淋洗时,当流动相成分变化后.孔内外流动相成分能迅速达到平衡,机械强度高,装柱容易,其局限性是由于多孔层厚度小,因而柱容量小,最大容许样品量受到限制,合用于比较简朴样品分析及迅速分析。
全多孔型固定相,由于颗粒很细,孔依然很浅.传质速度较快,柱效高。
梯度淋洗时孔内外流动相成分平衡速度依然较快.其最大特点是柱容量大,最大容许样品量是表面多孔型5倍,但装填什于渗入性低,因而需要更高操作压力.制柱比表面多孔型难。
这种固定相特别有助于痕量组分及多组分复杂混合物分离分析。
10、什么叫化学键合色谱?
与液—液色谱相比有何长处?
解:
通过化学反映,将固定液键合到载体表面,此种固定相称为化学键合固定相;采用化学键合固定相色谱法,称为化学键合色谱。
与液—液分派色谱相比,键合色谱法重要长处:
(1)化学键合固定相非常稳定,在使用过程中不流失。
(2)适当用梯度淋洗。
(3)适合于k范畴很宽样品。
(4)由于键合到载体表面官能团,既可是非极性,也可是极性,因而应用面广。
11、(选取题)在液相色谱中,惯用作固定相合相基体物质是
A.分子筛B.硅胶c氧化铝D.活性炭
解:
B.硅胶。
要形成化学键合固定相,所用基质材料应有某种化学反映活性,在四种固体固定相中只有硅胶合有硅醇基,是能进行键合活性官能团。
12、高效液相色谱柱有哪几种类型?
细径柱有什么长处?
解:
高效液相色谱拄大体可分为三种类型:
内径不大于2mm称为细管径或微管径柱;内径在2~5mm范畴内是常规高效液相色谱柱;内径不不大于5mm普通称为半制备柱或制备柱。
细管径柱重要长处是:
(1)分离效能高。
(2)流动相最佳流速低,消耗量少。
(3)可采用各种检测器,便于联用(CLCMS,CLC-FTIR)。
(4)采用细而短毛细管柱可以提高分析速度,实现迅速分析。
13、什么叫反相色谱?
试从固定相、流动相、流出顺序、流动相极性影响等几种方面比较正相和反相区别。
解:
流动相极性比固定相极性强色谱体系叫反相色谱。
例如以十八烷基硅胶键合相(ODS)为固定相,以甲酵/水作流动相,是典型反相色谱。
正相色谱和反相色谱这两种操作模式重要区别见下表:
正相和反相色谱区别
比较项目正相色谱反相色谱
固定相
流动相
流出顺序
流动相极性影响极性
非(弱)极性
极性组分k大
极性增长,k减小非(弱)极性
极性
极性组分k小
极性增长,k增大
14、对液相色谱流动相有何规定?
解:
用作液相色谱流动相溶剂,其纯度和化学特性必要满足色谱过程中稳定性和重复性规定。
对样品要有一定溶解能力,粘度小,化学稳定性好,避免发生不可逆化学吸附。
溶剂应与检测器相匹配,不干涉所使用检测器工作,制备色谱溶剂应不干扰对分离各组分回收。
除此以外,选取溶剂对所给定样品组分具备适当极性和良好选取性。
15、在150×2mm硅胶柱流动相为已烷/甲醇(150:
2),紫外检测器色谱条件下分离丙烯酰胺,判断如下组分出峰顺序,为什么?
解:
在给定色谱条件下,组分B先出峰,组分A后出峰。
以硅胶为固定相,己烷/甲醇(150:
2)为流动相,该体系为正相色谱,样品极性A>B,在正相色谱体系极性小组分先出峰,极性大组分后出峰,因此出峰顺序为B先出,A后出。
16、在硅胶往上,用甲苯为流动相,某组分保存时间为30min,如果改用四氯化碳或乙醚为流动相,试指出选用哪一种溶剂能减少该组分保存时间?
为什么?
解:
该体系为正向色谱体系。
在该体系中流动相极性增大保存值减小。
流动相甲苯、四氯化碳及乙醚溶剂强度参数分别是0.29、0.18、0.38,因而选用溶剂强度参数不不大于甲苯乙醚,可缩短该化合物保存时间。
17、在高效液相色谱中,组分和溶剂分子之间存在哪几种作用力?
解:
存在色散力、偶极作用、氢键作用和介电作用等四种作用力。
18、什么是溶剂极性参数与溶剂强度?
它们之间关系如何?
解:
溶剂分子与溶质分子以色散力、偶极作用力、氢键作用力及介电作用力四种方式进行互相作用能力称为分子“极性”,溶剂这种能力以溶剂极性参数P’表达,P’值越大,溶剂极性越强。
溶剂强度指用作流动相溶剂,将组分从色谱柱上洗脱下来能力。
溶剂强度直接与溶剂极性关于,并且随不同色谱体系而变,在正相色谱体系中,溶剂极性增长,使组分从柱上洗脱下来能力增长,即P’越大溶剂,溶剂强度越大。
在反相色谱中,溶剂极性减小,使组分从柱上洗脱下来能力增长,即P’越小溶剂,溶剂强度越大。
19、预测在正相色谱与反相色谱体系中,组分出峰顺序。
解:
在正相色谱体系中组分出峰顺序为:
极性弱组分,在流动相中溶解度较大,因而k值小,先出峰。
极性强组分,在固定相中溶解度较大,因而k值大,后出峰。
在反相色谱中组分出峰顺序为:
极性弱组分在固定相上溶解度大,k值大,后出峰,相反极性强组分在流动相中溶解度大,k值小,因此先出峰。
20、在ODS固定相上,以甲醇为流动相,某组分分派容量k1=1.2,如以乙腈为流动相,其k增长还是减少?
为什么?
解:
据题意为反相色谱体系。
k值增长,在反相色谱体系中,流动相由甲醇变为乙腈,溶剂极性参数由5.1变为5.8,增长了,但组分在流动相中溶解度反而减小,因此k值增大。
由1.2增大为2.24。
21、在反相色谱中,流动相从40%(V/V)甲醇—水变化为60%(V/V)甲醇—水,问组分调节保存值将变化多少?
为什么?
(P’甲醇=5.1,P’水=5.1)
提示:
对于由溶剂A和B构成二元混合溶剂,其极性可表达为
Pab‘=aPa’+bPb’
式中a和b分别为溶剂A和B在混合溶剂中分数。
解:
在40%配比时,混合溶剂极性为
P1’=0.46×5.1+0.6×10.2=8.16
在60%配比时,混合溶剂极性为
P2’=0.6×5.1+0.4×10.2=7.14
P2’=P2’-P2’=7.14-8.16=-1.02
依照反相色谱体系
∴在反相色谱中,流动相极性变弱(P’由8.16变为7.14),溶剂强度增长,洗脱能力增长,因而使组分调节保存时间减少到本来1/3.2。
22、某色谱体系采用25%三氯甲烷/正己烷为流动相,发现组分分离不十分抱负,想通过变化流动相选取性来改进分离选取性,选用乙醚/正己烷为流动相,问乙醚/正己烷比例为多少?
(P’CHCl3=5.1,P’乙醚=5.1)
提示:
流动相选取性变化是通过保持溶剂强度不变时变化流动相构成来实现,变化前流动相A/B和变化后流动相A/C构成有下列关系:
解:
25%CHCl3/正己烷与37%乙醚/正己烷溶剂强度相等,但对样品分离选锋性不同。
23、什么叫离子色谱?
解:
在低互换容量分离柱上,分离样品离子,而在高互换容量抑制柱上,通过化学反映,把具备高电导流动相转变为低电导流动相,这样就可以在电导检测器上对被分离样品离子进行高敏捷度检测。
这种采用分离柱、抑制柱和电导检测器相结合离子互换色谱称为离子色谱。
24、为什么凝胶色谱中任何组分分派系数必要符合0≤K≤1?
如果K>l阐明什么问题?
解:
由于组分分派系数为K=Cs/Cm,Cs与Cm分别为组分在固定相和流动相中浓度,当分子直径不不大于固定相孔径时,此时Cm=0,∴K=0。
当分子直径不大于孔径时,组分向孔隙内流动相扩散,达到平衡时,一半组分在孔隙内,一半在孔隙外,此时K=1.0,若分子直径介于以上两种极限状况之间,K一定介于0与1之间.可见在凝胶色谱中,任何组分分派系数为0≤K≤1,如果K>1,这阐明此时分离方式已不是纯粹凝胶色谱,其分离过程受到其她作用力(如吸附)支配。
25、某人用凝胶色谱分离一高聚物样品,分离状况很差,她变化流动相构成后,分离状况大为改进,这种说法对吗?
为什么?
解:
这种说法不对。
在凝胶色谱中流动相只起运载作用,不能依托变化流动相性质和构成来改进色谱体系选取性。
凝胶色谱选取性只能通过选取适当固定相,依照固定相孔隙大小以及孔径分布范畴最佳化来实现。
题目中“变化流动相构成后,分离状况大为改进”是不也许。
26、(选取题)液相色谱中通用型检测器是
A.紫外吸取检测器B.示差折光检测器C热导池检测器D.荧光检测器
解:
B.示差折光检测器。
A、D为选取性检测器,C为气相色谱中通用检测器。
27、为了测定邻氨基苯酚中微量杂质苯氨,既有下列固定相:
硅胶、ODS键合相,下列流动相:
水—甲醇、异丙醚—己烷,应选用哪种固定相、流动相?
为什么?
解:
邻氨基苯酚中微量杂质苯氨测定,为了良好分离,应让苯氨先出峰,由于苯氨极性不大于邻氨基苯酚,因而应采用正相色谱法,应选硅胶为固定相,异丙醚—己烷为流动相。
28、在ODS键合固定相,甲醇—水为流动相时试判断四种苯并二氮杂苯出峰顺序。
为什么?
解:
色谱条件为反相键合色谱体系,在反相色谱体系中极性大组分k小,一方面出峰,按四种苯并二氮杂苯构造,出蜂顺序为4—3—2—1。
29、用多孔凝胶为固定相,流动相为四氢呋喃,分离如下各组分,试判断各组分出蜂顺序。
为什么?
解:
凝胶色谱组分出峰顺序是依照分子尺寸大小,大先出峰.故出峰次数为n=9、8、7。
30、分离含胺类和季铵接样品,以0.2MHClO4溶液为固定相,以丁醇—二氯甲烷—己烷为流动相,已知组分A保存时间为8.2min,死时间为1.0min.在另一根柱上.其她条件均不变化,只将HClO4浓度增长一倍,间组分A在第二根柱上移动速率,是在第一根柱上几倍?
解:
从题意分析知,该题分离类型是正相离子对色谱,因而K与KBP关系为:
A在第二根柱上移动速率是第一根柱1.78倍。
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