Sanger测序是基因检测地金实用实用标准当前我国个性化医疗应优先推广李甫.docx
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Sanger测序是基因检测地金实用实用标准当前我国个性化医疗应优先推广李甫
Sanger测序“精准医疗”首选
Sanger测序是基因检测的金标准,当前我国“个性化医疗”应优先推广
作者:
李甫测序从业15年,资深基因检测专家单位:
北京三博远志生物技术有限责任公司
摘要:
上个世纪末90年代,与“曼哈顿原子弹计划”和“阿波罗登月计划”具有同样划时代意义的“人类基因组计划”启动,这是人类第一次在分子水平上全面地认识自我。
随着人类基因组计划的开展,人们对基因与疾病的关系认识更加深入,有机会通过对基因缺陷的检测分析来判断各种疾病发生的风险,并由此衍生出一种新的健康服务项目—基因检测。
“个性化医疗”即“精准医疗”就是指根据病人(或亚健康人)的个人基因组信息,量体裁衣式地制定个性化治疗方案(健康管理方案)。
它是由传统医疗联合遗传检测技术,为病人(或亚健康人)量身设计出最佳治疗方案(健康管理方案),以期达到治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。
Sanger测序经过38年的发展已相当完善,成本也降低了10倍以上,现在国际上仍然是基因检测行业的金标准和主力军。
sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准,是包括荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。
2010年以来,出现了很多新一代测序仪产品,新一代测序成本低、数据大、速度快,但都有待成熟,准确度不够高。
临床应用人命关天,精确第一。
我们对基因的了解还非常肤浅,有待去挖掘解读,一代测序要发挥精准、成本低的优势用于临床检测和验证,新一代测序要发挥高通量的优势用于研发和大数据的遗传检测。
一代测序技术
(一)、Sanger测序
被检测的DNA碱基顺序依次读出800bp以上,是一代所有测序和新一代所有测序的金标准。
代表仪器美国ABI3730XL,Sanger测序一般医院很少开展,开展的都发公司做。
耗时长达13年之久的人类基因组计划也是依靠Sanger测序法才得以最终完成的。
Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物,进行PCR扩增直接测序。
单个突变点的扩增(包括该位点在内的外显子部分片段的扩增),不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。
所以单基因或部分基因控制的疾病样本检测,Sanger测序可以发挥精准和成本低的优势。
●sanger测序的应用领域:
1、应用于医学测序、健康管理和基因潜力开发的精准检测:
将待检测DNA样本的某一个片段的碱基逐一精确检测,然后与已知的标准样本序列比较,寻找突变,发现突变与疾病(或能力、特点)的关系。
包括单基因遗传病检测、易感基因精确筛查、健康能力基因检测、个性化用药精确检测、血液和器官配型基因检测、天赋基因检测、个性特质、性格特点基因检测等。
目前该技术已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。
如p53基因、BRCA基因、APC基因的检测分析,可用于早期发现某些肿瘤的易感人群,如:
乳腺癌、结肠癌,对这些人群采取必要的生活方式调整、早期诊断及其它干预措施,从而达到预防医学治未病的效果。
Sanger测序可以助力癌症病人个性化用药,应用Sanger测序法对肿瘤靶向治疗药物相关基因的突变位点进行检测,结果直观、可靠,例如:
K-ras基因、C-kit基因、EGFR基因序列的突变检测分析,应该是判断肿瘤患者靶向治疗的有效人群,必不可少的检测项目,例如:
非小细胞肺癌,靶向药吉非替尼(易瑞沙)/厄洛替尼(特罗凯)/埃克替尼(凯美纳),用药前需检测EGFR突变,西妥昔单(爱必妥)/帕尼单抗(维克替比),用药前需检测K-ras突变,EGFR突变情况。
Sanger测序检测不同个体细胞色素P450耐药性基因,可以确定不同人对药物的敏感性和耐受程度,是个人用药剂量确定的重要依据。
国外,Sanger测序技术在临床方面的应用主要有两个途径,即商业化检测试剂盒的应用和CAP认证独立实验室进行相关项目的检测,例如:
HIV耐药突变检测试剂盒的商业化。
在美国,医学独立实验室必须具有CAP(CollegeofAmeicanPathologists,美国临床实验室/病理学家学会)认证资质,其在法律上是独立的经济实体,有资格进行独立经济核算并承担相应法律责任,在管理体制上独立于医疗机构,能立场公正地提供第三方医学检验,实验室本身对出具的检验报告负责。
发达国家Sanger测序技术已广泛应用于临床相关诊断和治疗中。
Sanger测序在我国临床应用较少。
2、为二代和芯片测序验证:
二代和芯片测序结果,需要sanger测序验证,原因请见“Sanger测序与其他测序方法流程、准确度对比”论述。
3、应用于细菌、真菌鉴定:
精确确定细菌、真菌、病毒种属,为微生物开发利用或杀灭提供依据,广泛用于食用菌和益生菌开发利用(例如:
食用菌品种开发改良、发酵工业、植物品种改良、石油地矿勘探等),解决饮料、食品、医药、酒类、包装等行业菌污染问题。
用sanger测序,在临床上通过16SrDNA等基因定序,实现各种感染性疾病的病原学精确诊断。
用sanger测序技术检测比传统的形态学鉴定具有方法简单结果准确的优势。
4、应用于科研基础测序:
sanger测序38年来立下了汗马功劳,sanger测序用13年完成人类基因组计划,现在NCBI公布的动、植物、微生物基因组序列都是由sanger测序完成的。
现在sanger测序仍然在临床科研、药物研发、动植物育种等方面发挥着不可替代的作用。
●Sanger测序的优势:
1、精准:
流程细致,质控环节多,污染低,结果直观可视,假性结果极低。
1.1、由于没有建库环节,所以微量样品不会任意扩大,从而产生假阳性结果(与二代测序比);
1.2、sanger测序首先要做PCR有限扩增,然后切胶回收主带,此过程不容易污染,即使有少量污染扩增出的杂带,切胶回收可以有效分离,切胶回收后,电泳前要用特异性单引物测序PCR反应一次,等于又筛选了一次,所以sanger测序这种方法非常精准,非常不容易污染。
1.3、sanger测序是建立在目的基因精确物理定位基础上的测序(得到的结果是连续的、可视的、真实的长片段,所以出来的数据不会张冠李戴,即使读错了结果,也可以从读取的峰图序列中判出(与荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、质谱法、芯片法、二代测序法等方法比);
1.4、基因突变可分为碱基置换、颠换、缺失和插入4种,sanger测序法对于任何一种突变都可以清楚读出,而无需提前预测、预置模版造成误断结果。
(与荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法、质谱法等方法比);
1.5、分子生物学实验是微观实验影响因素众多,由于样品和操作的差异,实验经常会出现失败,而做不出数据现象(这个概率至少是10—20%左右,其他测序方法判断是阴性结果,这样结果用于临床是否有点可怕?
),而用sanger测序法检测,如果琼脂糖凝胶电泳之前和电泳过程中,任何工序不理想,都无法进行下一道工序,也就无法拿到序列峰图,这种情况必须重新实验,这种情况sanger测序绝不会当阴性结果出具报告。
(与荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法比)。
sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准,是包括荧光定量PCRTaqman探针法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。
科研领域发表基因检测相关文章,必须要有sanger测序验证数据予以支持。
2、可进行个性化位点检测,可以任意选择单项测序,sanger测序个性化基因检测有价格优势。
由于临床测序特点是:
“目标明确、结果精准、通量小”,Sanger测序正好具备这个特点,非常适用于临床。
●我国sanger测序历史与现状:
最好的Sanger测序仪器是美国ABI3730XL系列产品,其他厂家仪器都被淘汰。
我国从2000年左右开始做sanger测序,当时主要用的是手工灌胶、手工点样、大板胶电泳的ABI377测序仪,和读长较短的MegaBACEDNA毛细管测序仪。
2002年,三博远志公司率先开始使用读长更长、全自动、毛细管核酸分析仪3730XL,引入全新3730XL操作技术,承包中国农科院闲置未用的两台仪器,把有限的测序资源变成了社会化服务,面向全国各高校、生命科研院所、医院等单位,为我国分子生物学研究发挥了重要的作用。
2008年4月,ABI生产的3130/3130XL测序仪获得中国CFDA颁布的医疗器械生产许可证备案[1]。
现在做sanger测序的公司集中在北京和上海,其他地方如有大部分是分公司,只收样不测序。
sanger测序经过15年市场自由竞争,现全国比较有规模的有20多家。
测序速度由原来的3天出结果,到现在12到20小时出结果,测序公司三班倒不间断提供服务,价格也成几倍下降。
由于国内众公司参与竞争,市场价格的降低、测序质量和服务质量的提升,原来的外资公司和国企测序公司难以为继,这几年纷纷撤出、转型,例如:
当年测序业务火爆的大连的日资宝生物公司几年前就撤出了测序市场、美资的英潍捷基公司被赛默飞世尔收购,现在测序业务基本放弃,2010年华大公司主要力量转到了深圳做了二代产前唐筛,私企三博远志公司也开始转型到基因检测应用领域,重点为医院和健康管理提供咨询服务。
sanger测序成本的大量降低和服务水平的不断提高,原来拥有测序仪器的科研单位和医院,在项目申请时必购置的仪器,由于缺乏专业的维护管理(毛细管核酸分析仪必须天天使用,否则仪器毛细管堵塞测序结果会很差,分析仪器要求每天必须有大量样品去跑板,否则就得空跑,导致维护仪器成本极高)样品数量问题、人员技术问题、成本问题,使国家大部分仪器都成了摆设,现在这项服务90%以上靠生物公司社会化提供。
现在由于国家发改委物价局没有给sanger测序服务核定收费名录,所以该项目一般医院很少开展,少数开展的三甲医院由于sanger测序上述特点不适宜在医院做,适合在第三方专业检测机构做,一般都发到公司测的。
国内用药都是按照说明书程式化使用,基因检测个性化用药几乎是零。
得了癌症手术、化疗、生物靶向药物、放疗、中药一起用,多种药重复用,哪个药贵用哪个,导致疗效差、副作用大、医药资源浪费。
2014年统计,发达国家癌症治愈率达到65%。
而没有大规模开展基因检测的中国,癌症治愈率仅为25%左右!
另人痛心[2]。
以上局面的产生主观上是医院创收的驱动,及病人、家属治愈心切的驱使,但客观上是国民包括医生缺乏基因检测及个性化用药知识的普及和基因检测应用的环境(审批环境),部分癌症病人为了解决个性化用药问题直接找公司。
公司因法律限制是不能直接接收的(sanger测序拿不到临床证)。
Sanger测序不容易出现错误结果,国家一直没有监管,但应该无一投诉。
尽管Sanger测序公司无临床资质,但一直在为已开展测序业务的医院做临床基因检测服务。
sanger测序在我国15年,总的来说,在科研测序方面市场发挥了支配地位作用。
国内测序公司紧跟国际生物热点动态,将国外先进的测序技术引入中国,并且不断进行自主研发和技术创新。
之前,虽然有的国企性质的公司和科研单位,测序用试剂由国家免费提供,他们也参与市场竞争具有某些成本优势,但质量、服务、价格优势不大,国家相关部门没有行政干预,所以这些年sanger测序的发展充分尊重了市场规律,在科研应用领域的到了充分的竞争和无情的筛选,正是因为这样,我国sanger测序为我国分子生物科学研究发挥了巨大的作用,国内短短十几年做出了大量科研成果,发表了大量分子生物学科研论文,我国的分子研究技术水平已达到了国际水准。
但是自从2014年7月,部分公司二代测序有了临床许可证[3],而sanger测序没有准入证以来,sanger测序临床应用举步维艰。
国家卫计委为二代测序和一代芯片试点发证,给荧光定量PCR发证,而不给sanger测序发证,二代测序出生5年就能发准生证,sanger测序已出生15年表现又这么好,竟然是黑户。
是否有失常理、有失公平呢?
(二)、亲子鉴定、法医鉴定
通过测定DNA片段的长度和颜色,来确定遗传关系。
是sanger测序技术基础上,发展起来的一个技术,所用仪器与sanger测序所用仪器一样,检测原理一样,一台设备装两套检测软件,一台仪器具有三个功能。
代表仪器美国ABI3130、3130XL、3730仪器,一般司法机构和sanger测序公司拥有该仪器,医院没有。
亲子鉴定就是通过对DNA遗传片段检测,判定父母与子女之间的亲缘关系。
(三)、SnaPshot测序技术
SNaPshot技术是美国应用生物公司(ABI)开发,是荧光标记单碱基延伸的分型技术,也称小测序,主要针对中等通量的SNP突变分型项目检测。
通常用于10~30个SNP突变位点分析。
是sanger测序技术基础上,发展起来的一个技术,和sanger测序仪器一样,检测原理一样,一台设备装有两套检测软件,一台仪器具有三个功能。
代表仪器美国ABI3130、3130XL、3730仪器,一般sanger测序公司拥该有仪器。
优势:
1、分型准确,2、通量高,3、检测速度快,4、不受SNP位点多态性特性限制,5、不受样本个数限制。
SNaPshot技术是新一代测序技术(包括二代测序和芯片测序)SNP突变检测的金标准,sanger测序技术又是SNaPshot技术突变检测的金标准。
(四)、实时荧光定量PCR
利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线(或者与内参对照)对未知模板进行定量分析。
代表仪器美国ABI7500荧光定量PCR仪等,一般三甲医院都有该类仪器,普及较好。
使用方便维护简单。
1、突变寻找:
定量PCRTaqMan探针杂交。
2、基因定量:
相对荧光定量PCR,医学上用来检测细菌或病毒RNA的表达量。
荧光定量PCR是1996年由美国ABI公司推出的一种新定量实验技术。
●实时荧光定量PCR应用领域:
临床疾病诊断:
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价,地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测,肿瘤标志物及瘤基因检测,遗传基因检测。
新一代测序技术简介
1、二代测序
2010年以来,出现了很多新一代测序仪产品,例如:
美国RocheAppliedScience公司的454基因组测序仪,美国Illumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪,美国AppliedBiosystems公司的SOLiD测序仪,所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法(cyclic-arraysequencing),也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。
●二代测序技术当前面临的问题:
二代测序由于要受建库、扩增、测序深度(成数)、小片段组装拼接、人工数据判读等影响,该技术原理决定了“不准确、不稳定、可重复性差”的问题难以突破,有望更新一代测序加以解决。
此外,基因测序结果的解读成了目前最大的难题,这也是众多科学家不愿意推进其商业化的原因之一。
基因测序大数据越来越具有两面性,一面是被投资者看好,被认为是未来的现金奶牛;另一面则好像潘多拉的盒子,基因测序结果解读不成熟,一旦商业化,解读对用户是陷阱?
是误导?
2、一代基因芯片技术
基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的原理,对样品的序列信息进行判读和分析的一种测序方法。
它可用于基因表达谱的分析、突变检测、多态性分析、基因测序和基因组文库作图等研究,同时在人类疾病的检测、预防等方面也具有初筛价值。
●一代基因芯片技术当前面临的问题:
尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展,得到世人瞩目,但仍然存在着许多难以解决的问题,例如:
技术成本高、复杂,检测灵敏度较低,重复性较差,分析泛围较狭窄等问题。
微阵列实验是成百上千个核酸探针进行“同时杂交”,影响芯片探针和靶片段结合效率的因素来自多个方面:
序列自身因素(序列长度、碱基比例、互补性等)、杂交实验条件(探针和靶序列浓度、阳离子浓度、pH等)及非特异性杂交片段等。
目前的芯片制作工艺还难以保证每个探针杂交反应,同时具备最佳反应条件,因此,实际的芯片探针杂交往往会产生大量的假阳性和假阴性。
就单个基因测定的精度而言,高通量微阵列并不如低通量的Northern、real-timePCR等技术。
芯片突变检测验证要依赖于sanger和SNaPshot测序技术。
基因芯片上成千上万的寡核苷酸探针,由于序列本身有一定程度的重叠因而产生了大量的丰余信息。
要对如此大量的信息进行解读,目前仍是一个艰巨的技术问题。
3、第三代测序技术
在第二代测序技术不断完善和广泛应用的同时,第三代测序技术已经初现端倪。
第三代测序技术的主要特点是能够对单个DNA分子进行直接测序。
第三代测序技术目标是实现人的全基因组三分钟的测序时间,5000美元的测序价格,这为个人全基因测序的普及奠定了基础,将会满足未来临床诊断与疾病治疗,个人基因组大数据序列信息的需求。
第三代测序技术原理很好,但现还在实验阶段,很不成熟。
Sanger测序与其他测序方法流程、准确度对比
二代测序和sanger测序方法有两点不一样(见下表):
1、二代测序法是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子,然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库,获得测序模板,2、用大于sanger测序几十倍的成数进行小片段测序,然后根据重叠的部分用软件自动寻找组装拼接。
造成二代测序实验结果的偏差的原因:
一是,建库环节非常容易出现污染(对实验室要求很高),二是,无限倍扩大、扩增过程中由于不同基因的偏好性,会失真会偏差,三是,二代测序100bp,sanger测序长度800bp,在短片段拼接过程中,会找错地方、拼错位置,四是,对比、分析、推理出报告环节,会掺入人为的主观臆断。
同样,一代芯片测序虽然没有像二代测序有建库环节,但标记、杂交环节容易出问题,电子信号识别会把没有杂交上去的失败实验判定为阴性,由于样品问题和操作问题可能会出现较大假性结果概率,同样像二代测序一样有对数据进行对比、分析、推理出报告的环节,带进主观臆断成分,造成实验结果可重复性不高。
而sanger测序由于是直接测序,这些情况不会发生。
笔者公司常年承接新一代测序验证工作,二代测序和一代芯片测序有时失真很厉害,客户反映:
“大量测序二代便宜,但有时物种都会搞错,只好用sanger测序重头再来”。
有的用二代测序筛查遗传病,查不出问题,返回来找一代测序重做,一代测序结果一般和预期是一致的。
笔者认为新一代测序过多用于临床有失偏颇。
有的公司用一代芯片做基因健康检测大套餐,结果非常雷同,检测不出什么实质问题。
二代芯片重复性不高的案例:
我们曾把同一个人的样品,寄到23andme和国内XXX公司,做同样套餐项目(两家用同样的仪器,相同测序技术),对比其结果相似性只有60%左右。
美国23andMe公司使用的Illumina公司的Solexa测序平台,2013年11月份被叫停,2015年,美国FDA依旧没有解除对23andMe的限制,理由是“疾病检测具有一定风险,万一检测失误,人们由于恐惧将来会得乳癌,就切除了乳房。
人们的健康损失、谁来担此责任?
都成了不得不考量的问题。
既然是医疗设备,就要受到监管……”[4]
测序流程
一
二
三
四
五
六
七
结果
准确度
Sanger测序
DNA或RNA提取制备
PCR有限扩增纯化
单引物PCR测序反应筛选
毛细管长片段电泳检测
质检,出具报告
连续可视的峰图和800bp
序列
高
二代测序
DNA或RNA提取制备
DNA随机切割成小片段
末端连接上接头制成文库
微乳液PCR
电泳测序获得小片段序列
大量小片段筛选拼接组装
对比分析推理出报告
依据众多100bp序列拼接分析推理组装的序列
受外部条件影响大有待提高
一代芯片
DNA或RNA提取制备
核酸标记
杂交
洗脱、染色
扫描芯片
对比分析推理出报告
设想预置突变位点电子信号推理结果
受外部条件和序列影响大,有待提高
三代测序
DNA或RNA提取制备
单分子直接读取数据
质检,出具报告
原理科学,技术很不成熟
结论:
一代测序要发挥精准、成本低的优势用于临床检测和验证,
新一代测序要发挥高通量的优势用于研发和大数据的遗传检测。
十几年来,我国sanger测序由于具有很多优势,在科研领域中发挥了巨大的作用,但临床上远未充分发挥作用。
我们对基因的了解还非常浅薄,有待去进一步挖掘解读,二代和芯片技术准确度不高有待成熟,所以当前我国“精准医疗”即“个性化医疗”临床应用要优先推广一代测序,特别是sanger测序的主力军作用。
2015年1月20日,奥巴马在国情咨文演讲中提出了“精准医学(PrecisionMedicine)”计划,呼吁美国要增加医学研究经费,推动个体化基因组学研究,依据个人基因信息为癌症及其他疾病患者制定个体医疗方案。
1月30日奥巴马正式推出“精确医学计划”,提议在2016财年向该计划投入2.15亿美元,以推动个性化医疗的发展。
创建一百万名志愿者小组建立数据库,研究他们DNA的关联和差异性[5]。
“精准用药”要做基因检测但并不仅仅只是基因组测序大数据处理,其范围更广,是对受检者与相关微生物(如感染因子、共生微生物等)的遗传物质(包括DNA、RNA、染色体)及其产物(如蛋白质、代谢物及小分子)进行检测,为疾病诊疗、健康管理提供信息与线索。
帮助找到疾病主因的精确缺陷,进而精准用药。
注意:
美国人提出的“精准医疗计划”是“投资去研究”“个体化基因组学”、“以推动癌症等病治愈率”,而不是“大量推广应用”。
“精准医疗”我国现在应该推广应用的是,“补上所欠的功课”量体裁衣、应用各种成熟的测序技术为临床服务,特别是sanger测序,而不是“高大上”测序。
疾病=基因缺陷+外因,撇开外因,人类基因所携带的信息浩如烟海,目前所获得的只占其中很少的一部分,还有大量的信息等待全球的科学家去解码。
有权重的基因热点突变检测才有意义和价值,炒基因概念只是浪费钱财。
Sanger测序可以精准检测特定的热点基因突变,发挥“目标明确、结果精准、相对便宜”的优势,就像一群鸟中有几只病鸟,我们要研究有病的那几只,没有必要全部打下来研究,而研究有病的那几只就可以一样道理。
各种测序技术要扬长避短,临床应用原则是能用一代测序的绝不用新一代测序。
人命关天再慎重也不为过。
新药研发最起码得十五年以上才可以用于临床,而新一代测序应用才五年。
未来医学的方向是“寻证+个性化医疗”
“寻证”是寻找和疾病有关系的基因及作用机理,“寻证”就是功能基因组学临床研究,要做大量人群测序,任务非常艰巨。
人类对基因了解甚少,我国基因研究非常薄弱,我们还没有国人基因数据库。
高通量测序要发挥研发的优势。
数据库是基因检测的软实力,也是高通量临床检测的基础和前提。
撇开准确度问题,测出一大堆数据解读不了也没用。
我们多年承接医院委派癌症用药检测业务,发现国人EGFR、K-ras基因很少有突变,欧洲人开发出的癌症生物靶标药物,是依据欧洲人基因靶突变位点开发的,中国人很少有突变,用后效果低于10%。
例如:
靶向药吉非替尼(易瑞沙)/厄洛替尼(特罗凯),西妥昔单抗(爱必妥)/帕尼单抗(维克替比),大部分中国人使用效果不佳,癌症面临无好药可用的囧境。
国人基因GSTT1、GSTM1、GSTP1突变型比例很大,但代表的意义应该不完全和欧美人一样,等等这些有待研究。
“个性化医疗”是对不同病人的基因进行检测,把大量临床总结好的热点基因应用到不同个体的过程。
“个性化医疗”应用是少量精准测序,用一代测序完成更适合、更好。
国内多年“浮躁”心里的作祟,
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