基因工程跨课程综合性实验讲义资料.docx
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基因工程跨课程综合性实验讲义资料
基因工程(跨课程)综合性实验
基因工程·发酵工艺原理·生物技术药物药剂与药动学
生命科学与生物制药学院
基因工程(跨课程)综合性实验教学小组
2007年5月
(非正式出版物,请莫外传)
前言………………………………………………………………………………3
一、实验项目……………………………………………………………………4
二、实验日程……………………………………………………………………7
三、实验分组……………………………………………………………………9
四、实验要求与质量控制………………………………………………………10
五、重组蛋白质药物……………………………………………………………12
(一)重组蛋白药物背景知识…………………………………………………12
(二)重组蛋白药物实验流程…………………………………………………16
1、工程菌构建………………………………………………………………….19
2、工程菌表达筛选…………………………………………………………….21
3、甘油种制备………………………………………………………………….25
4、生长曲线分析……………………………………………………………….27
5、表达影响因素实验………………………………………………………….30
6、表达进程分析……………………………………………………………….32
7、工程菌发酵工艺…………………………………………………………….34
8、表达产物分离纯化………………………………………………………….37
附录一:
SDS-PAGE……………………………………………………………..42
六、重组DNA药物……………………………………………………………..44
(一)重组DNA药物背景知识………………………………………………..45
(二)重组DNA药物实验
1、质粒DNA大规模制备……………………………………………………….48
2、质粒-脂质体复合物制备……………………………………………………52
3、TCR体外基因转染、表达检测和活性检测……………………………….53
4、TCR体内给药试验………………………………………………………….60
附录二
1、紫外吸收测定……………………………………………………………….61
2、可见光吸收测定…………………………………………………………….63
前言
生命科学与生物技术的最主要任务之一是利用其理论与技术研究成果为人类的健康服务,生物技术制药则是其最主要的应用领域,且在重大传染性疾病、恶性肿瘤及其它疑难杂症防治方面具有巨大的潜力。
药品的研究开发是一项庞大的系统工程,实验室研究发现的任何候选药物要开发成新药都需要经过生产工艺和质量控制研究、有效性评价和安全性评价等过程。
需要特别指出的是,生产工艺和质量控制研究的内容和任务还会始终贯穿于产品投产上市的过程中,相应的技术手段也是作为企业生产或质量控制人员必备的技能。
因此,作为生命科学与生物制药学院的本科生,了解生物技术药物研究、开发和生产的过程、掌握与生产工艺和质量控制研究密切相关的技术手段是非常必要的。
以蛋白质为基础的基因工程药物和基因工程抗体是当今最主要的生物技术药物形式,以DNA为基础的基因治疗制剂和DNA疫苗是未来生物制药的主要发展方向之一。
《基因工程》、《发酵工艺原理》和《生物技术药物药剂与药动学》是与重组蛋白质和重组DNA类药物的生产工艺与质量控制研究、以及安全性与有效性评价方面关系最为密切的专业课程,且相互构成了基因工程制药的上、下游关系。
本综合性实验即为上述三门课程的跨课程综合性实验,其目的在于培养学生理论联系实际的能力,对重组蛋白质和重组DNA等当今和未来最主要的二大类生物技术药物的研究、开发和生产有一个系统的了解,使所学课程的理论知识和实践技能系统化,为以后从事生物技术药物方面的工作打下较好的基础。
本综合性实验分为“重组蛋白质类药物”和“重组DNA类药物”二个单元。
“重组蛋白质药物”单元设置了包括工程菌构建、发酵和分离纯化工艺等基因工程药物主要工艺研究内容在内的实验项目;“重组DNA药物”单元设置了包括质粒DNA大规模制备、质粒-脂质体复合物制备、体外基因转染和体内给药试验等DNA药物主要研究内容在内的实验项目。
在具体实验内容设置时,综合考虑了前修课程《分子生物学》和《生物工程下游技术》的实验课已学内容、本综合实验总学时数(108学时)和实验室现有条件等因素。
表1基因工程(跨课程)综合性实验项目说明
序号
实验项目
学时
说明
公开课
4
介绍综合实验设计思路、内容、流程、实施计划、要求等。
I
重组蛋白质药物
50
1
工程菌构建
2
已完成。
回顾工程菌hIL-18(PR/PL控制下的hIL-18,42℃诱导)和GST(Ptac控制下的GST,IPTG诱导)的构建。
2
工程菌表达筛选
10
从pVB220-hIL-18转化子中随机选取8株,温控表达,SDS-PAGE分析表达结果,选取一高表达菌株作为hIL-18的工程菌。
3
工程菌甘油种制备
2
将选定的hIL-18工程菌制成甘油种保存于-70℃。
4
工程菌生长分析
6
利用工程菌生长过程中的菌体密度测定绘制生长曲线、了解生长特性。
5
诱导时机对工程菌生长与表达的影响
10
观察生长曲线中的早、中、晚期对菌体生长与目的基因表达水平的影响,以决定表达诱导最佳时机。
6
工程菌表达进程分析
10
观察工程菌表达诱导过程中目的产物积累进程。
以GST菌株进行。
7
工程菌发酵
2
菌种活化起始的发酵工艺全过程及全自控发酵设备与单元操作演示
8
表达产物分离纯化
6
超声波法破碎菌体,包涵体分离、纯化,变性与复性、柱层析纯化(示教)。
II
重组DNA药物
50
1
工程菌构建
2
已完成,回顾目的基因克隆、表达载体(pDNA3.1-TCRVβ7.1)构建。
2
质粒DNA大规模制备
10
工程菌培养、碱法裂解、阴离子交换柱层析纯化、琼脂糖电泳鉴定、DNA纯度测定。
3
质粒-脂质体复合物制备
6
以脂质体包被纯化所获重组质粒,以紫外吸收法测定包封率。
4
T淋巴细胞体外转染
8
以质粒-脂质体复合物转染T细胞
5
转染T细胞目的基因表达检测
4
以流式细胞仪分析转染T细胞中目的基因的表达情况(学生制备样品、老师操作流式细胞仪)。
6
转染T细胞体外活性检测
10
以转染的T细胞攻击肝癌细胞,以流式细胞仪分析杀瘤活性(学生制备样品、老师操作流式细胞仪)。
7
转染T细胞体内给药试验
10
荷瘤鼠建模、目的基因体内转染与表达分析(部分内容示教)。
实验总结暨试验技能知识竞赛
4
对综合实验性实验进行总结,讲解实验报告要求,并据情况组织相关知识竞赛。
二、实验日程
(日期:
07/6/4——07/6/22;作息时间:
9:
00-21:
30)
班级
日程
04
(1)班
(先做重组蛋白质药物单元)
04
(2)班
(先做重组DNA药物单元)
第1天
4日/6月
星期一
Am:
综合实验公开课(课室:
B2-314,8:
30准时开始)
Pm:
单元讨论、IL-18工程菌构建、
IL-18菌种活化接种和平板划线接种
Pm:
单元讨论、TCR工程菌构建、
TCR菌种活化接种
第2天
5日/6月
星期二
工程菌表达筛选(温控表达诱导)
工程菌生长曲线分析
质粒DNA大规模制备:
碱法裂解、中和、异丙醇沉淀、洗盐
第3天
6日/6月
星期三
工程菌表达筛选SDS-PAGE
(凝胶保存备用),选定菌株,接种
质粒DNA大规模制备:
层析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质粒纯品纯度和浓度
第4天
7日/6月
星期四
工程菌甘油种制备
表达影响因素试验(诱导时机的影响)
表达进程试验接种(GST菌种)
质粒-脂质体复合物制备、包封率测定、T细胞体外基因转染
第5天
8日/6月
星期五
表达影响因素试验SDS-PAGE
(胶保存备用)
表达进程试验(IPTG诱导、不同时间点取样)
转染T细胞体外活性检测之一:
肿瘤细胞接种,培养
第6天
9日/6月
星期六
准备
转染T细胞目的基因表达检测:
T细胞-肿瘤细胞共培养、流式样品制备和检测
第7天
10日/6月
星期日
准备
转染T细胞体外活性检测之二:
流式细胞仪分析细胞凋亡
第8天
11日/6月
星期一
表达进程分析SDS-PAGE(胶保存备用)
转染T细胞体内给药实验
试验结果讨论与分析、看病理与免疫组化照片
第9天
12日/6月
星期二
SDS-PAGE凝胶扫描分析(三次电泳胶)
发酵罐观摩(418室)
准备
第10天
13日/6月
星期三
表达产物产物的分离纯化(示教)
试验结果分析与讨论
重组DNA药物单元开始,
TCR菌种接种
准备
第11天
14日/6月
星期四
质粒DNA大规模制备:
碱法裂解、中和、异丙醇沉淀、洗盐
工程菌表达筛选(温控表达诱导)(前一天下午IL-18接试管与平板划线)
工程菌生长曲线分析
第12天
15日/6月
星期五
质粒DNA大规模制备:
离子交换层析纯化、电泳鉴定、紫外吸收法测定质粒纯品纯度和浓度
工程菌表达筛选SDS-PAGE
(凝胶保存备用),选定菌株。
第13天
16日/6月
星期六
准备
准备
第14天
17日/6月
星期日
下午接种(每组派1个代表)
下午接种(每组派1个代表)
第15天
18日/6月
星期一
质粒-脂质体复合物制备、包封率测定、T细胞体外基因转染
工程菌甘油种制备
表达影响因素试验(诱导时机的影响)
表达进程试验接种(GST菌种)
第16天
19日/6月
星期二
转染T细胞体外活性检测:
肿瘤细胞接种,培养
表达影响因素试验SDS-PAGE
(胶保存备用)
表达进程试验(IPTG诱导、不同时间点取样)
第17天
20日/6月
星期三
转染T细胞体外活性检测:
T细胞与肿瘤细胞共培养
表达进程分析SDS-PAGE(胶保存备用)
第18天
21日/6月
星期四
转染T细胞体外活性检测与目的基因表达检测:
流式细胞仪分析
SDS-PAGE凝胶扫描分析(三次电泳胶)
发酵罐观摩(418室)
第19天
22日/6月
星期五
转染T细胞体内给药实验
试验结果讨论与分析
表达产物产物的分离纯化(示教)
试验结果分析与讨论
备注:
1)带有阴影字体所述实验的菌株为GST菌株(Tac启动子,IPTG诱导)。
2)综合实验公开课安排(第一天,6月4,星期一)
8:
30~9:
00黄院长讲话(开设实验的背景、对学生的要求)
9:
00~10:
30全体实验教师亮相,然后由李黄金做综合实验整体介绍
10:
30~10:
40休息十分钟
10:
50~12:
00就实验安排和内容等提问和答疑(双向)
(请安排有经验学生摄影)
13:
30分班按所进行的实验单元进行工程菌构建回顾与讨论(以实验室分班和小组为单位)
三、实验分组
1、分组
每个班按学号顺序分为8组,组号按序依次为1-8组,每组人数分别为9、9、9、8、8、8、8、8。
涉及到排序的实验项目,如在超净工作台上的接种步骤,一律按1到8组顺序进行。
2、编号
实验过程中必需对试管、摇瓶等进行标记,故统一进行编号。
编号规则为:
班代表字母+组号-成员号,A代表1班,B代表2班。
举例:
04
(1)班1组1号同学挑取的转化子标记为A1-1;
04
(1)班8组8号同学挑取的转化子标记为A8-8;
04
(2)班1组1号同学挑取的转化子标记为B1-1;
04
(2)班8组8号同学挑取的转化子标记为B8-8;其余以此类推。
3、实验安排
生物制药04
(1)班先进行“重组蛋白质药物”单元的实验,然后进行“重组DNA药物”单元的实验。
生物制药04
(2)班先进行“重组DNA药物”单元的实验,然后进行“重组蛋白质药物”单元的实验。
具体教室见实验中心的通知。
4、注意事项
由于综合实验内容比较多,希望各位同学精诚合作,特别是分光光度计、离心机等仪器的使用,由于数量有限,请发扬团队精神,尽量按顺序或同步进行以节约时间。
四、实验要求与质量控制
综合实验涉及的知识点和实验技术众多,为了培养学生严谨求实、科学求真之精神,并达到综合实验之最大成效,以下对本综合实验过程的要求进行说明,且纳入实验考核成绩。
1、预习
实验前须充分预习,要求随机抽查时,每一位同学能够清晰的阐述整体实验思路和具体的实验项目、原理。
2、实验过程
除了遵守学校与学院一般实验纪律与要求外,还必须做到主动性、能动性与团队精神相接合,利用有限的资源与时间得到最好的培训与实验结果。
为此,本综合实验将能否在规定时间内完成实验内容作为衡量学生动手能力的关键指标之一,并作为考核结果记入实验成绩中。
要达到此目的,同学们必须提前仔细阅读实验讲义,全面了解实验内容,透彻理解实验原理,熟悉各个操作步骤,并在实验过程中合理安排时间。
3、实验原始记录与结果整理
每天必须及时、真实、完整地记录当天所做实验情况,记录实验过程中的异常情况,分析其原因,并将下述关键性实验结果整理于实验报告纸:
I重组蛋白质药物单元:
1)表达筛选与甘油种制备:
随机挑选转化子表达诱导SDS-PAGE凝胶扫描照片、筛选确定的工程菌株株号及其表达水平(%)。
2)生长曲线分析:
选定工程菌培养过程中的OD600测定结果表及生长曲线图。
3)表达影响因素试验:
不同诱导时机表达诱导实验诱导前、后样品的SDS-PAGE凝胶扫描照片、表达水平、OD600值。
4)表达进程试验:
工程菌(GST)表达诱导过程不同时间点样品SDS-PAGE凝胶扫描照片、表达水平。
5)表达产物分离纯化:
示教分析与讨论
II重组DNA药物单元:
3)质粒DNA大规模制备:
阴离子交换纯化层析图、提取和纯化过程中样品琼脂糖电泳图、质粒纯品纯度和浓度测定结果。
3)质粒-脂质体复合物制备:
包封率测定结果
3)基因转染、体外表达、体外活性、体内给药:
示教分析与讨论
4、综合实验报告
须按《基因工程(跨课程)综合实验论文撰写规范》撰写、并提交综合实验报告(电子打印版及电子版)。
1)封面:
标题:
基因工程(跨课程)综合性实验论文
姓名:
班级:
学号:
指导教师:
李黄金、周林、胡海梅、赵林、陈伟、段涛、张玲、袁茵
薄华本、王金全、吴凤麟
广东药学院
生命科学与生物制药学院生物制药研究所
2)知识产权申明
本综合性实验所采用的工程菌株与工艺技术参数主要来源于广东药学院生物制药研究所的相关课题与研究成果,相关知识产权归广东药学院生物制药研究所所有,未经许可不得擅自影印相关讲义和使用相关工程菌株与工艺技术参数。
3)论文内容
中英文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
结果与讨论
参考文献
致谢
五、重组蛋白质类药物
重组蛋白质类药物统称基因工程药物,该类药物通用名常冠以“重组…”前缀,因采用基因工程或重组DNA技术手段生产而得名。
该类药物在化学和生物学本质上属于人源或其它动植物和微生物来源的、具有高度生物学活性的蛋白质或多肽,它们在自然界的含量极微,传统的天然提取工艺常难以达到工业规模和质控要求,而基因工程则为此类活性物质的工业规模高效生产提供了手段。
利用基因工程手段生产的最终目的是在一个合适的系统中,使外源基因高效表达,从而生产有重要价值的蛋白质产品。
广义的基因工程包括外源基因的克隆、表达载体和表达系统的构建、表达生产(发酵)和分离纯化等过程。
外源基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。
目前用于基因工程药物生产的原核表达系统主要是大肠杆菌系统,真核表达系统主要有毕赤酵母(Pichiapastoris)系统和哺乳动物细胞CHO系统。
大肠杆菌系统因具有操作简单、表达水平高、生产成本低等优点而在基因工程制药中具有不可替代的地位。
本综合实验以hIL-18的大肠杆菌表达系统为例,全面介绍和学习工程菌构建、表达筛选、甘油种制备、生长与表达分析、发酵工艺单元操作和表达产物分离纯等基因工程药物研发与生产实践中最常用的技术与工艺过程。
(一)、背景知识
1、工程菌及工程菌构建
工程菌在基因工程产业中是特指经基因工程手段构建的、用于生产的菌种。
工程菌构建包括目的基因的获得、表达载体的构建、转化、转化子表达筛选、传代稳定性分析、鉴定和种子库建立等内容。
2、基因工程药物工艺与质控
基因工程药物工艺研究包括工程菌构建与分析、发酵工艺(上游工艺)研究、分离纯化工艺(下游工艺)研究和制剂工艺研究等内容,质控研究则贯穿于工程菌构建和上、下游工艺研究的全过程,并以工程菌菌种库、半成品原液和成品为主要质控点。
3、目的基因在大肠杆菌中的表达形式
根据表达产物使用目的的不同和操作方法的差异,目的基因(外源基因)在大肠杆菌内可以以不同形式进行表达。
根据表达产物定位可分为胞内表达和分泌表达二种基本形式;根据表达产物多肽链的N端或C端有无其它氨基酸序列可分为融合表达和非融合蛋白等二种基本类型;另外,在胞内表达方式下,根据表达产物的可溶与否,还可分为包涵体方式表达和可溶方式表达。
在大多数情况下,非融合蛋白和融合蛋白的胞内高效表达(非分泌表达)产物常以不溶的包涵体形式存在。
非融合表达:
指目的蛋白的N端和C端均不带有目的蛋白以外的氨基酸残基。
为了表达非融合蛋白,使用的外源基因必须具有从起始密码子到终止密码子的完整读码框架。
非融合蛋白的一级结构和天然蛋白质相同,是一些体内应用基因工程产品的必要条件,但是小分子非融合蛋白在原核细胞内不稳定,易被降解,而且不易纯化。
融合表达:
即在目的蛋白的N端或C端带有其它的氨基酸序列。
为了表达N端融合蛋白,一般在表达载体的SD序列之后加上起始密码子,其后为一段原核读码框架,接着是克隆位点。
外源基因经处理后克隆到该位点,其读码框架必须和上游的原核读码框架符合。
表达C端融合蛋白的载体,在SD序列之后为克隆位点,其后是一段带有终止密码子的原核读码框架,将只有起始密码子而没有终止密码子的外源基因插入到克隆位点,必须保持外源基因的读码框架和载体上原核读码框架相符合。
融合蛋白在大肠杆菌细胞内较稳定,不易被细胞内的蛋白酶降解。
作为融合蛋白一部分的原核多肽往往可以利用来纯化、检测该融合蛋白,这种多肽又称作“标签”(Tag)或受体蛋白,目前最常用的标签有His6和GST。
分泌表达:
所谓原核细胞的“分泌型表达”是指在细菌胞浆内合成的多肽进入内膜和外膜的周间质,而不是指合成的多肽分泌到细胞外。
将一段原核或真核细胞的信号肽序列连接到欲表达基因的上游,在表达的蛋白进入细胞周间质时,信号肽被信号肽切割酶系统(各类蛋白酶)水解,产生游离的表达产物。
分泌型表达可以保护外源蛋白不被细胞内的蛋白酶降解,增加表达产物的稳定性。
由于表达的蛋白可以在周间隙进行折叠,具有天然蛋白的构象,所以分泌型表达的蛋白一般具有生物活性。
分泌型表达的缺点是表达量较低,有时会产生信号肽不完全切割的融合蛋白,有时会发生非特异性切割,应慎使用。
4、原核表达载体的基本组成元件
启动子:
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列,它是基因表达的“发动机”,是基因表达最关键的调控元件。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所应用的启动子必须是原核启动子。
将外源基因克隆在其下游,原核RNA聚合酶识别该启动子后,带动真核基因在原核细胞中转录。
原核表达系统中常采用可调控的强启动子,基于乳糖操纵子调控模型的启动子是最常用的启动子,包括Lac(乳糖启动子)、LacUV5(突变型乳糖启动子,不受葡萄糖阻遏)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)和T7启动子(来自T7噬菌体的强启动子和RNA聚合酶组合)等,它们可由乳糖诱导,在实践中主要采用不易被降解的乳糖类似物IPTG作诱导剂。
λPL和PR(λ噬菌体的左右启动子)是另一类较常用的强启动子,其诱导模式主要基于其阻遏蛋白的温敏型突变子,即高温(42℃)失活,启动目的基因转录。
SD序列:
在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3-10bp处的由3-9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16SrRNA的3’末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点,即为SD序列。
SD序列与AUG的距离将显著地影响基因的表达水平。
转录终止子:
构建表达载体时,为了防止目的基因表达时转录过头和干扰载体的稳定性,一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的转录终止序列或采取双终止子串联。
复制起点:
载体自我增殖所必不可少的基本条件,并可协助维持使每个细胞含有一定拷贝数的质粒。
在一般情况下,一个质粒只含有一个复制起点。
标记基因:
表达载体通常采用的标记基因是抗生素抗性基因,有利于重组表达载体转化子的筛选,常用的抗生素筛选标记基因为氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因。
5、人白介素18(hIL-18)
hIL-18又称IFN-γ诱生因子,由活化的巨噬细胞产生,主要生物学活性是诱导Th1细胞产生IFN-γ,诱导T细胞产生GM-CSF,促进T细胞和NK细胞增殖分化、促进Fas配体表达,抑制新血管形成,因此,在感染性疾病、恶性肿瘤和免疫性疾病方面具有较大的潜在应用价值。
成熟的hIL-18是由157个氨基酸残基组成的多肽,分子量约为18KD,不含信号肽和糖基化位点,内含4个半胱氨酸残基,但并不形成二硫键。
本实验单元即以hIL-18为重组蛋白质药物代表。
(二)重组蛋白药物模块实验流程
实验一工程菌构建
(工程菌构建回顾)
1.pBV220-hIL-18表达载体和工程菌构建
在本综合性实验中目的基因的表达载体为pBV220,该载体的物理图谱见图2。
该载体有一个氨苄青霉素抗性基因,在多克隆位点的上游为λ噬菌体的PL和PR启动子,PL和PR启动子受λ噬菌体CI基因的负调控。
CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白,在28-37℃培养时,CI产生抑制作用,在温度升至42℃时,CI被破坏,这样就解除了对启动子的封闭,使PL和PR启动子开始下游基因转录。
目的基因为hIL-18的编码序列(cDNA),采用RT-PCR技术从外周血细胞中获得。
首先据Genebank报道序列设计引物,并在引物的5’端引入EcoRI位点和启始密码子ATG,在3’端引入HindⅢ位点。
IL-18基因的RT-PCR扩增产物经EcoRI和HindⅢ双酶切插入表达载体pBV220的相同位点即得hIL-18的表达载体pBV220-hIL-18。
构建的表达载体pBV220-hIL-18按常规方法转化大肠杆菌DH5α株后即得“重组hIL-18”的工程菌。
图3pBV220的物理图谱
2.pGEX-GST表达载体和工程菌构建
pGEX-GST为商品化融合表达载体,主要用于外源基因的可溶性融合表达。
GST(谷胱甘肽转移酶)为大肠杆菌宿主细胞的天然高效、可溶性表达的蛋白。
以其作为融合表达“标签”有二点优势:
a)GST可以促进二硫键的形成,使目的基因融合表达产物能正确折叠,因而常以可溶的表达产物存在;b)GST属于大肠杆菌高效表达的天然产物,其mRNA的5‘端具有最适的结构,有利于融合基因mRNA的翻译,因此可大大提高融合基因
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