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病原物
病原物-寄主互作中的转录图谱
关键词:
聚类分析,遗传基因组学,元分析,最低限度信息,微阵列,植物实体,信号转导级联反应
摘要:
使用基因组技术可以解决在整个发育过程或者生化途径背景下的的研究假设,基因网络,相关基因的染色体位置并且可以推断其进化史。
通过一系列的平台,研究者可以用多种试验和条件研究整个转录物组。
这些数据的诠释产生新的见解,并可以揭示之前没有描述过的现象。
在植物病菌相互作用的领域,转录图谱在以下给出了前所未有的见解:
以基因对基因为基础的防御和基础防御的机制,寄主对非寄主,生物存活者与死亡者,维管与非维管病原体的致病性。
这样,基因组技术使广泛系统方法更加便与在寄主与病原体相互作中统一理论和独特特征。
引言
通过多种试验和条件研究可以解决在整个发育过程或者生化途径背景下的研究假设。
根据全基因组序列,关于RNA快速积累的数据和蛋白表达模式使判断基因如何对复杂的表现型起作用成为可能。
转录图谱的遗传继承性可被用于绘制染色体的相关位置,调整其位置。
另外,基于已知作用的基因的表达模式,比较在模式生物中的基因表达网络和作物物种可被用于推断作用和进化史。
植物病理学中的热点包括以基因对基因为基础的防御和基础防御的机制,寄主对非寄主,生物存活者与死亡者,维管与非维管病原体的致病性。
已经阐述了不同的表达技术和在大规模生物学统计设计的重要性。
我们着重在关键的系统,比如怎样有效地利用转录图谱来促进在寄主-病原物方面的生物发现。
随着在公共数据库中大量的微阵列数据的增加,使用元-图谱方法作出结论建立多种实验,也很有益。
不同的实验设计和操作是公认的避免得到错误结论的前提。
在之前共数据中可以得到新的信息,不同的基因表达模式可用于包含几个试验的元分析的涉及的观点。
模式系统用于作物:
不仅仅是只在拟南芥中
平行表达图谱,曾经被认为仅仅在有基础结构的大的研究群体有用,现在认为可以用于小的群体和单独的实验室。
生物的多数微阵列平台通过商业和公共资源存在。
现货供应,高密度DNA阵列现在应用于大麦,小麦,水稻,玉米,甘蔗,葡萄,柑橘,杨树,土豆,拟南芥,芸苔,棉花等其他物种。
微阵列除了可以用于检测平行基因中成千上万的表达,许多方案已经应用这个技术通过多物种阵列的共同刺激发展研究寄主和病原物,比如大豆/豆疫酶(根腐)/线虫病(大豆囊肿),苜蓿属/紫蓿/根瘤菌,禾谷镰刀菌(scab),水稻/稻瘟病(riceblast).许多公司与研究者合作生产常规阵列(寡核苷酸测定位点)在一个合理的价格。
这个可行的技术提供了一个机会,在相同实验条件下研究寄主与病原物整个途径的调节。
实验设计要考虑的事
不同的设计回答不同的问题
典型的,有人对mRNA的转录图有兴趣,在一系列特殊条件或者处理被大量积累或者减少。
处理是涉及到的控制条件的转录图谱的困扰,可能是一个植物病原体基因型,一个突变体,一个时间进程,温度,或光照条件等。
在病原物-寄主互作中,这对于结合候补植物基因型的时间过程或分离的病原体引出的应答非常有用,可以用一个假设用相关的有价值的历史知识来验证。
实验至少应该这样设计,可选的假定可以做出评估。
环境因素一定要考虑到(生长地点,温室,大田),寄主基因型(相同基因型或多种基因型),病原物菌株(反应,相同基因型或多种)和接种技术。
最终,表达图谱的特定应用依赖于被问到的问题。
如果表达数据用于描述确定的生物学系统的结论,比如寄主-病原物互作,严格的统计设计,重复,和分析是很重要的。
另外,还可以为下游功能分析提供支持,通过对特殊基因或者敲除突变体转录的分析实验。
不管是问什么问题,或者询问什么系统,与分析表达专家详尽的讨论是你设计表达图谱或者其他在大规模生物学中试验的一个先决条件。
使用案例:
多重侵袭和反侵袭策略
致力于白粉病的三个例子说明用作平行表达图谱的差别。
第一个案例解决机制:
病原物阻止寄主防御反应,以便建立基本的亲和性或者生物活性。
植物易感或者抗病的机制是什么?
Caldo和他的同事们研究了全部的转录数据,在大麦和白粉病Blumeriagraminisf.sp.hordei中亲和与不亲和互作中总体转录产物积累量的不同.。
几个设计组合可以便于数据分析和解释:
(A)多重寄主基因型对比,(B)候补病原体分离,(C)基于真菌侵染动力学历史数据的时间过程的选择,(D)严谨的统计标准(模式化,随机,重复)。
他们利用3×2矩阵组成三个大麦近等基因系,含有渗入基因Mla6,Mla13,andMla1含有CC-NBS-LRR结构的抗性等位基因,使用对照B.graminishordei5874(AvrMla6,AvrMla1)或者K1(AvrMla13,AvrMla1)侵染,接种后0h,8h,16h,20h.24h和32h观察结果。
3×2矩阵最大设计可以使至少两个独立的寄主分离产物被用于评价每个被问得问题。
(Figure1).
其中最有意义的非平行基因图谱表现出一个大于150个基因的共基因簇,接种16hai在亲和和不亲和互作中均有显著上调,同时伴有B.graminishordei无性孢子的萌发和附着孢的结构。
Figure1
二次抑制设计用于评价在大麦与白粉病菌,Blumeriagraminisf.sp.hordei.
亲和不亲和互作中转录产物的积累。
用了四个对照来研究亲和和不亲和相关的基因,由植物的基因型(绿圈)或者分离的病原物决定(红圈)。
两个对照用于检测关于非依赖Rar1和依赖于Rar1的基因(蓝圈)。
转录的下调仅发生在亲和互作16小时之后真菌吸器和寄主表皮细胞的接触,但是这些转录在非亲和互作中持久或者增加。
(Figure2d)。
许多这些基因,像展示在Figure2c中的那些,是涉及到非特异性,PAMP(病原物相关分子模式)诱发的基础防御途径。
然而,受检测Mla等位基因控制的不亲和互作中,特殊病原物接收器的识别引起增加表达的维持。
相比之下,缺少MLA或者对应的效应子蛋白,与不亲和互作相比,转录上调和下调的特异时间点观察到预测的亲和性和关于植物转录物重新编程的不协调性。
这些结果与假说一致,寄主调控是病原物受动器的目标。
近来在MLA互作的核定位方面的工作表明这些基础抗性调节子的两个是一对转录因子,HvWRKY1和HvWRKY2。
HvWRKY1/2,AtWRKY18/40的拟南芥同源物显示与反馈阻遏系统有关,作为基础防御的控制条件。
第二个案例说明的是非宿主植物抗性的分子基础。
拟南芥不支持B.graminishordei.的生长和无性繁殖。
分生孢子将会萌发形成附着包,但是大多数不会穿透表皮细胞壁和乳状突起。
但是,拟南芥是白粉病Erysiphecichoracearum和E.orontii的寄主。
拟南芥突变体pen3-1被B.graminishordei侵染,允许增加穿透力。
PEN3编码假定的三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运体PDR8。
pen3-1对死体营养型Plectosphaerellacucumerina缺少抗性,还有两种非宿主植物的E.pisi(豌豆白粉)andPhytophthorainfes-tans(马铃薯晚疫)。
但是,pen3-1对E.cichoracearum有抗性。
要研究在寄主和非寄主互作中的基因表达,Stein和他的同事们用AffymetrixArabidopsisATH1GeneChip对比寄主(E.cichoracearum)和非寄主(B.graminishordei)白粉病来鉴定接种一天后在野生型和突变体pen3-1表达中的差异。
在微阵列中设置22810个探针,4240个被认为在E.cichoracearum和B.graminishordei感染株中有不同的表达,期望值小于0.001。
就像预测的,基因被病原物侵染所诱导或者抑制。
Figure2
在不同寄主-病原物互作中的重叠和保护基因表达。
Selectedtime-course
expressionprofilesofdifferentiallyexpressedgenesannotatedtot引起芳香族氨基酸的生物合成的莽草酸途径中不同基因的表达的选择的时间过程表达图谱。
(a)Erysipheorontii侵染拟南芥的抗性反应。
E.orontiicultures接种4周大的哥伦比亚野生型植物的三个独立复制,叶片编号7-10在6,12,18,24,48,72,96,and120hai获得(b)Fusariumgraminearum侵染大麦的转录图谱.分离与Butte86的F.graminearum侵染Morexspikes的四种生物复制,mockwatercontrol在24,48,72,96,and144hai时取;(c)在拟南芥-E.orontii互作中,篮框标注的基因是上调,红框上调,黑框无差别(见附注表Table1).在大麦-F.graminearum互作中,病原接种后,在实框中的基因表达上调,虚框表达物差别。
在大麦–B.graminishordei互作中,所有表达均有差异.(d)基因的子集界定为在B.graminisf.sp.Horde侵染大麦的亲和和非亲和互作中差异表达。
亲和和非亲和互作的发生由C.I.16151andC.I.16155近等基因系(各自包含Mla6andMla13抗性等位基因)的两个产物引起,和这两个B.graminishordei菌株,5874(AvrMla6,AvrMla1)andK1(AvrMla13,AvrMla1)。
B.graminishordei接种第一个叶片的三个独立复制在0,8,16,20,24,and32hai获得。
pen3-1介导的对E.cichoracearum抗性反应是水杨酸(SA)依赖型,同样的,SA途径基因,比如PAD4,SID2,EDS1,andEDS5和下游的SA途径标记,与野生型相比在pen3-1中上调。
另外,用B.graminishordei与E.cichoracearum相比,侵染植物后转录产物有显著的升高或者降低,与先前的实验AFGC(拟南芥功能基因组学)cDNA阵列关于在寄主与非寄主互作中水杨酸或茉莉酮酸酯或者乙烯防御途径的研究一致。
水杨酸途径中基因的上调说明pen3-1-介导的对E.cichoracearum防御反应很可能是水杨酸途径的放大激活所引起的。
Stein和他的同事假设拟南芥植物对于B.graminishordei的穿透力有更明显反应,因为拟南芥不能抑制寄主基础防御反应就像E.cichoracearum可以。
第三个案例关系到与向生体性基因相关的寄主基因。
白粉病是活体营养的病原物,可以维持寄主细胞存活来获取营养,同时最小化组织伤害。
然而,当数以千计的白粉病分生孢子落在同一个叶片上时,结果会出现多种。
比如,分生孢子在侵染过程可以成功,发育形成功能吸根,但是另一个却没有。
因此,很有可能依赖于是否侵入成功的单个细胞的转录产物会有不同的变化。
为了研究在单个侵染细胞的转录变化,Lyngkjaer和他的同事发明了新的关于大麦表皮细胞的显微操作系统。
这个系统的关键是单个的抗性和侵染易感染大麦被侵染表皮细胞可以很容易的被区分,通过接种B.graminishordei18hai后微观观察大麦叶片来区分。
随后,这些的包含物和无接种的抑制细胞收集起来提取mRNA,扩增,与IPK(Gatersleben)大麦PGRC110kcDNA阵列杂交。
等级聚类和多维排列用于观察样品间的关联。
显而易见,蔗糖合酶的上调在感染细胞是特异的。
另外,在抗性和易感细胞两个己醣转运子全都上调,基因与蔗糖运输也有联系。
同时的发现物,与来自幼苗叶片无接种处理的样品相比已经在接种的中发现,BB2增加,据报道糖运输相关基因在B.graminishordei接种后有明显的上调。
这些预测的糖运输多酚氧化酶基因dsRNAi使单个细胞沉默产生更明显的抗性表型,说明病原物调控这些植物基因来控制糖对于活体营养生长的可利用性,就像预测的拟南芥接种E.cichoracearum后的观察数据。
通过比较,编码预测UDP-葡萄糖脱氢酶和碱性的/不带电的转化酵素的基因沉默产生更多的易感表型,说明蔗糖分隔是在病原物识别的上游。
为了明确寄主基因对于白粉病侵染建立的重要性,Lyngkjaer和他的同事目前分析了包含吸器的大麦细胞的一个时间过程(12–48hai)的表达数据。
这些分析对于破译关于生物生存建立的基因有深远的意义。
这三个例子强调接种和组织收获方法的使用是依赖于正在解决的问题。
在植物细菌互做中,比如,假设叶肉细胞反应决定分化脉管和非脉管细菌病原物,这个假设可被证实,通过注射渗透技术使细菌通过气孔暂停进入叶肉非原质体,得到渗入组织的转录图谱。
在气孔孔隙细菌诱导变化的机制,另外,通过沾取或者喷洒接种后的防御细胞的转录组的图谱变化可以更好的解决,通过激光切割技术(LCM)也可解决。
对于要解决的问题一个创造性的方法和细心地调整有不可预知的能力。
因此平行表达技术可以应用于大多数的问题,关键是根据特定生物的优势或者略势设计出最好的一系列实验。
显著性水平,错误的发现率和生物意义:
高产量成果
这些数据的第一个用途通常是获取最有意义的方法或者使用严格限度的途径,并且允许一个模式结构描述生物结构。
这些统计的限度通常与低的错误率(FDR)或qvalue相联系。
然而,应该评估一个对于生物系统被迫应用于限制的使用者,生物系统应该评价这个,最后,一些最令人感兴趣的基因或者基因表达的方式没有消除。
这些可能更难应用,因为他们是高FDR群体的一部分。
然而,通过逐步的使用数据结果是有用的,首先是通过严格的限度,然后是接连更宽松的标准来发现其他基因,与最初的模式是相似的或者相反。
比如,在一系列的调查中开发利用关于大麦-白粉病互作的基因的数据结果,Caldo和他的同事最初使用限度pvalue<0.0001,FDR<7%。
这分析用于获得主要的有意义具差别的调控基因簇,这些调控基因与B.graminishordei侵染的动力学相关联。
随后,开始一个更为宽松的门槛pvalue<0.001,确定了81个额外基因。
尽管错误发现率相关的pvalue<0.001是20%,通过评估单个时间点的表达曲线,提取的这81个基因中28个具有相同的表达模式的,与最初分析确定的前22个一样。
进一步说,在values<0.01限度下收集到最有意义的500个基因,进行中等信号轻度的聚类分析,基于表达图谱将这些基因归类于3大主要类群。
这3个主要的类群中第三类群包括207个基因,包括21个不在最初的22个确定的基因,限度为pvalues<0.0001,且随后的28个基因确定(pvalues<0.001),这些有同一的时间过程表达模式。
类群3中预测基因的21个被注解与莽草酸途径有关,导致次级代谢产物的合成。
(Figure2c)
除了放宽低的错误率(FDR)或者确定额外的基因,这些额外的基因与一定的图谱相符,也应该根据筛选基因家族或者功能组重新见检查数据。
比如,Carr和他的同事重新分析了Huang的数据,与一个特殊基因相关联。
Huangetal实验的最初目的是检测的在拟南芥防御途径突变体的防御相关基因(寄主病毒亲和互作)表达中的作用。
然而,Carr和他的同事感兴趣的是8个HSP100基因家族成员的作用,可以在阵列中表现出来。
他们利用这些数据确定只有HSP101被用于研究的病毒所诱导,并且这个基因的表达独立于突变体防御信号途径。
基于这些数据的分析,他们得出结论HSP101和其他热休克蛋白由病毒诱导,调控独立于防御相关基因途径。
生物系统
植物-菌互作:
比较分析StealthandBruteForce隐力和暴力
活体营养真菌和卵菌,需要活的寄主提供营养,尽量避免输出和激活寄主防御反应,直到可以完成生活周期。
如果寄主抗性基因存在,就会快速识别引起防御反应阻止病原的进一步入侵。
在防御反应中诱导的很多基因有也在亲和性中诱导,尽管他们有不同的动力学原理。
一个最好的例子是Figure2c中显示的莽草酸途径。
这个途径的酶类催化反应,导致产生芳香族氨基酸和与植物保护有关的次级代谢产物,比如,生物碱,苯丙醇,木质素。
Figure2和续Table1,mRNA的大量转录是拟南芥和E.orontii,大麦和B.graminisHordei互作。
Figure2d,筛选基因的表达在亲和和不亲和中比较。
这些数据包括了接种后的早期时间且说明接种超过第一个16小时后,不管互作类型,在莽草酸途径中的基因表达普遍上涨。
超过16hai相当于吸器形成,这些基因的图谱有了分化,他们在不亲和中留在高的表达量但是亲和互作中降低。
拟南芥-E.orontii的亲和互作揭示与大麦–B.graminishordei互作方式的不同(Figure2a)。
拟南芥中莽草酸途径中基因的显著诱导不像大麦–B.graminishordei互作中的那么早,而是晚(在24–48hai)。
很想知道,这些基因是否在大麦–B.graminishordei亲和互作的晚些时候也被诱导。
最后,在大麦–F.graminearum亲和互作显示一个图谱与拟南芥-E.orontii互作的相似(Figure2b),尽管F.graminearum为半活体营养型,莽草酸途径中的基因在48–72hai间隔期诱导,相当于真菌快速繁殖期和非选择性毒素的积累。
这些基因表达的增加可能是普遍的防御机制,由R-Avr互作加强。
B.graminishordei侵染大麦表皮细胞,但是也诱导小麦局部获得性防御,一种非宿主植物。
因此,对于这种病原菌,人们感兴趣的是表皮细胞表上面的渗透对叶肉细胞的影响。
Bruggmann和他的同事分析了提取于小麦不亲和反应表皮细胞或者中胚叶的RNA样品。
B.graminishordei侵染引起在表皮和叶肉中转录产物积累显著变化,证明系统信号发生。
就像预期的,大量的防御蛋白被诱导。
但是大多叶肉中的比表皮中的有更多的折叠变化。
Sec61alpha亚基(AY044237),钙网织蛋白和亲环蛋白编码基因(这些是关于蛋白分泌的基因)的表达在叶肉中诱导的更多,与此同时还有发病机理相关基因的增量表达。
Caldo和他的同事对数据进行了更深的分析,揭示在大麦B.graminishordei互做中关于分泌蛋白的一系列基因的诱导。
同样,编码几种分泌蛋白的基因在拟南芥防御Pseudomonassyringae时被诱导,这些蛋白对于防御蛋白的分泌和系统获得性抗性非常重要(SAR)。
因此,分泌物和防御基因的伴随诱导在谷物中发生,就像在拟南芥中,说明在植物防御中有高度保守机制。
寄主与尸养寄生物互作中COI1-依赖性信号网络
拟南芥-Botrytiscinerea和拟南芥-Alternariabrassicicola是寄主与尸养寄生物互作的模型。
B.cinerea引起野生型拟南芥发病,病害在coi1突变体中加强。
Brassicicola不引起野生型拟南芥发病,但是coi1突变体易感。
使用AffymetrixArabidopsis8KGeneChip进行了研究野生型和突变体植物对这两种病原物的局部反应,对A.brassicicola的系统抗性使用包含2375ArabidopsisESTs(基于防御和信号转换)DNA阵列进行了研究。
在B.cinerea中的实验,根据侵染(24hai)的不同时间间隔取样,早期侵染(36hai),后期定植(60hai)。
A.brassicicola样品在12,24,and36hai收集,所有的相当于侵染的早期。
在这些试验中,462B.cinerea诱导基因(BIGs),645A.brassicicola诱导基因(AIGs)在野生型植物第一36hai确认。
coi1突变体缺少茉莉酸途径(JA),影响了几乎462BIGs的三分之一和645AIGs的五分之二的表达。
许多受影响的基因与JA/ET介导的防御有关,比如PDF1.2,HEL1和抗氧化剂,还有JA合成酶。
这些数据说明COI1依赖型基因防御尸养病原物的关系。
在B.cinerea例子中,这些效应基因的诱导伴随着至少30种调节转录因子的表达增加,其中27个是COI1依赖型。
在这些基因中的14个突变体分析确定了两种转录因子WRKY70andZFAR1,调节反应保护拟南芥不被B.cinerea侵染。
这些数据说明JA-/ET介导的防御在保护植物防御尸养寄生物的重要性和使人了解调控这些防御的复杂网络。
在寄主中真菌表达图谱
除了寄主细胞中不同基因的表达,考虑在侵染位点病原物基因的表达也是必要的。
使用激光捕获显微镜(LCM)同时还有荧光AmCyanprotein-tagging检测Col-letotrichumgraminicola(造成玉米茎腐病)基因表达的研究,,来获取用于微阵列分析的样品。
这方法确定了超过8000个基因,在接种后两天在C.graminicola显著表达,这是侵染的早期相对真菌积量少。
相似的另一个寄主病原物互作的研究,在侵染后两天,没有使用LCM,导致仅有900个表达真菌基因被确定。
因此,LCM显然的丰富了真菌mRNA和在真菌mRNA转录物方面发现方面有了数量级的提高。
对比在体外培养的和植物生长的基因表达显示分泌蛋白的显著上调,可能意味着效应子和其他蛋白的产生是致病性需要的。
对于确定如何在这些样品中收集玉米细胞并且这些样品中对C.graminicola也有反映。
Both和同事发现了在B.graminishordei基因中协调表达的许多模式,使用cDNA微阵列图谱表达实验来界定代谢途径,检测在大麦中的侵染循环。
这对真菌侵染寄主植物的无性繁殖阶段,真菌的代谢情况有了评价。
当附着包形成时编码降解糖酶的基因有显著的上调,在包含真菌吸器的被侵染的表皮也是如此。
在白粉病侵染后寄主植物显示出糖运输和利用相关基因的上调,为营养物的获得提供来源。
活体营养锈菌侵染寄主组织通过细胞间菌丝,菌丝在活体植物细胞中形成吸器。
Jakupovic和他的同事据吸根特殊cDNA文库的EST序列,确定了基因在豆科锈菌Uromycesfabae的活体营养生长的表达。
Uromyces的几个ESTs与inplanta诱导的基因(PIGs)相似。
病毒编码顺序的确定,为在U.fabae.Subsequent微阵列实验的两个RNA微病毒提供证据,实验显示与夏孢子萌发相比在锈菌侵染的叶片中许多CDNA显著表达的,说明在发芽和发育的活体营养阶段锈病基因表达有变化。
为了检测子囊菌门的B.cinerea(一种广泛用途的植物病原体),在实时侵染条件下,Gioti和他的同事用B.cinerea侵染拟南芥叶片,使用常用的微阵列检测转录产物。
7%的B.cinerea基因在侵染期差异表达,有27个基因明显上调。
其中的2个基因,车轮菌属加氧酶和并环戊二烯合酶,已经与真菌致病性关联,但是8个还没有确定功能。
这27个基因成簇组成3个家族,第一个家族在真菌侵染后早期阶段显示出最大化的表达,第二个在植物叶片定植的的开端显示出最大化的表达,第三个在植物叶片定植完成时显示出最大化的表达。
与FKBP12蛋白同源的一个基因从第三基因簇中得到,经过基因断裂被错误的认为是致病性决定性因素。
几个丝状菌的基因组近来被测序,使基因组广泛性表达分析有了可能。
G¨uldener和他的同事利用F.Graminearum(造成小麦和大麦的叶尖部萎蔫的镰刀霉的病原生物,)基因组序列,设计了全基因组(1
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