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水产动物分子标记辅助育种研究进展
水产动物分子标记辅助育种研究进展
鲁翠云,匡友谊,郑先虎,李超,孙效文
(淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室,中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070)
摘要:
本文介绍了水产动物分子标记辅助育种技术的发展。
获得与经济性状连锁的标记是开展分子标记辅助育种的基础,因此,本文重点介绍了获得基因/标记技术的进步,探讨了基因/标记与性状间相互关系的复杂性,论述了准确鉴定性状紧密连锁的基因/标记的难度,指出难点主要源于基因组对性状的形成具有非常复杂的影响。
近十年来,已有多个利用分子标记辅助育种技术培育的品种在产业上应用,表明这项新技术具有推动产业技术进步的作用;同时指出了分子标记辅助育种包括全基因组选择育种的不足之处,其根本原因在于鱼类性状的形成机制极其复杂、多变,从而决定了分子标记辅助育种技术具有发展阶段论的特征。
关键词:
水产,分子育种,数量性状基因座(QTL)
分子标记辅助育种(markerassistedselection,MAS)是借助与性状紧密相关的分子标记对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择育种,是分子生物学和基因组学的研究结果应用到水产养殖物种品种选育的技术。
由于基因/标记代表性状的遗传基础,因此这项技术被誉为从传统表型选择亲本提升到根据基因型选择亲本的革命性的技术进步。
2009年孙效文等[1]对同一问题的综述和专著[2]认为,开展DNA水平的标记辅助育种是科学发展的必然,既包括育种技术的发展,从统计学分析DNA提供的多位点选择明显优于表型性状提供的少数位点;又包括基因/标记是性状的遗传基础,从基因或基因组与性状的关系获得的标记是用于选择优良性状的最根本的工具。
2009年至今,基因/标记已运用到我国大多数水产养殖动物的种质鉴定和品种选育研究中,取得了较大的进步,具有非常好的发展前景。
本文综述了水产动物分子标记辅助育种技术的研究现状,探讨了应用标记辅助育种技术的难点以及未来的发展方向。
1水产动物分子标记辅助育种的相关基础研究进展
1.1水产动物DNA分子标记的开发
DNA分子标记的种类很多,主要包括限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)、简单重复序列(simplesequencerepeat,SSR)和单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。
由于RAPD标记和AFLP标记呈显性遗传,难以检测到隐性等位基因,在连锁分析中容易丢失位点;而RFLP标记虽然呈共显性遗传,但是其技术流程相对繁琐,因此,逐渐被新型的分子标记技术所取代。
SSR标记和SNP标记因其多态性高、共显性遗传、易于规模化检测等优势成为理想的分子标记。
同时,得益于二代测序技术的进步,使SSR和SNP标记的开发成本大大降低,一次测序就可以获得几十万甚至上百万个标记[3,4]。
SNP标记仅鉴定一个核苷酸位点的碱基组成,在实验室的检测难度和工作量高于SSR标记,更适合规模化和自动化的检测。
因此,目前多数实验室SSR标记以PCR产物的电泳检测分型为主,而SNP标记以高通量的测序或芯片检测分型为主[5]。
1.2经济性状连锁的基因及功能分析Growthhormonereceptor,GHR
自上世纪八十年代,很多鱼类的基因被克隆,其中生长激素(growthhormone,GH)基因很可能是最早克隆的基因,也是最早用于水产种质鉴定和品种选育的基因[6]。
1988年发现虹鳟(Oncorhynchusmykiss)GH基因有2种结构类型[7],有意思的是这2种类型的基因在鲑科鱼类中普遍存在,并且多数具有与性别连锁的特征[8,9]。
与GH紧密相关的另一个基因是生长激素受体(growthhormonereceptor,GHR)基因,生长激素与其受体结合起到调节骨骼、肌肉生长,最终达到促进生长的作用。
在养殖鱼类中已经克隆了多个GHR基因的亚型[10-12],但是与GH基因被广泛地用于水产育种研究不同,GHR基因很少用到,仅有一些应用性的探索[13,14]。
用到品种选育的基因还有胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors,IGF)及其受体,白俊杰团队在大口黑鲈(Micropterussalmoides)新品种的选育过程中发现,随着选育代数的增加,IGF-I基因上SNP位点的生长优势基因型的富集程度也增加了[15]。
另外,IGF-IR作为育种的选择标记在美国农业部批准生产的沟鲶(Ictaluruspunctatus)品种(USDA303)得到验证,其快速生长品系肌肉中的IGF-IR的表达量(mRNA)比较慢生长品系高两倍以上[16]。
肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因具有肌肉发生负调控功能,被誉为动物蛋白生产的重要基因。
水产动物中也有多个物种的MSTN基因被分离出来,如沟鲶、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)、鲤(Cyprinuscarpio)和栉孔扇贝(Chlamysfarreri)[17-21],但尚未见利用MSTN基因进行辅助选育的报道。
利用与性别连锁的基因/标记进行单性苗种的生产,是雌雄个体差别较大的水产动物的养殖业者追求的技术。
因此,鉴定性别相关基因/标记是水产遗传研究的重要目标之一,但水产动物性别连锁基因/标记很难鉴定。
II型生长激素可能是最早被鉴定与性别连锁的基因,也已用在鲑和鳟的单性鱼苗的生产上[9,22],通过基因型分析剔除遗传上的真雄鱼,完全用生理上的伪雄鱼与正常的雌鱼受精生产全雌鱼。
青鳉(Oryziaslatipes)Dmy/dmrt1bY是鉴定到的第一个决定鱼类性别的基因[23,24],其它鱼类的决定性别基因多数是以此为基础获得的。
Mei等[25]介绍了在鱼类中雄性决定基因呈现出多样化的特征,即使在同一属的鱼类中,也有不同的性别决定基因。
目前已发现多个鱼类雄性决定基因,如gsdf(吕宋青鳉,O.luzonensis),sox3(恒河青鳉,O.dancena),amhr2(红鳍东方鲀,Takifugurubripes),Amhy(银汉鱼,Odontestheshatcheri),sdY(虹鳟),dmrta2(斑马鱼,Daniorerio)。
但Dmrt1是很多种鱼类的雄性决定基因,包括青鳉、半滑舌鳎等。
Mei等[25]总结有14种养殖鱼类雌性明显大于雄性,如半滑舌鳎,陈松林等[26]发现了多个与半滑舌鳎性别有关的基因,其中包括决定雄性的Dmrt1基因;有11种养殖鱼类雄性显著大于雌性,如黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco),已发现多个与黄颡鱼性别相关即决定雄性的候选基因[27-29]。
虽然黄颡鱼性别相关标记已鉴定多年并应用于生产全雄鱼,但黄颡鱼的性别决定基因和作用机制尚未完全阐明。
尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)也是雄性大于雌性的主要养殖鱼类,Li等[30]通过基因敲除、敲入可以精巧地控制性别,并认为amhy/amhrII是较为重要的性别决定因子;Tao等[31]认为与先前已鉴定的性别基因(Foxl2,Cyp19a1a,Gsdf,Dmrt1,Amh)紧密连锁的还有Gtsf1,tesk1,Zar1,Cdn15和Rpl等基因;Wei等[32]认为Sox基因家族的很多成员参与了罗非鱼性别决定。
石斑鱼(Epinepheluscoioides)的特点是雌雄转化,Xia等[33]发现Dmrt1在性别转化中起重要作用,认为无内含子Dmrt1可能是刺激雌雄同体性腺中精子发生的重要基因,研究表明Sox3和Sox9等基因也参与了石斑鱼的性别分化。
总之,作为变温动物的鱼类性别决定机制极其复杂,获得的相关基因也远多于哺乳类动物等性染色体已特化的物种。
上述养殖鱼类的性别决定基因和性别决定机制的研究正处于深入发展阶段,在各种组学技术快速发展的现阶段,阐明几个物种的性别分化的生物学机制,获得一些有突破性的结果是可以预期的。
病害造成的损失是水产养殖业遇到的最大损失,因此,鉴定抗病相关基因的研究特别受重视。
首先可以给鱼类抗病基因初步确定一个广泛的定义,即在抵抗病原体入侵过程中起积极作用且有利于鱼类存活的基因。
目前获得的鱼类抗病基因大致可分为三类,一是免疫过程的基因如主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)通路上的基因;二是动物通用的杀灭病原体的基因如抗菌肽(antimicrobialpeptide)和干扰素(Interferon)等的基因;三是针对特定病原体研究获得的相关基因。
贾震虎等[34]分析硬骨鱼类MHCI由于具有多样性的多肽结合区PBR(pepetide-bindingregion)、基因结构的多态性和干扰素刺激应答元件ISRE(stimulatdresponsesequence),推测其对抵抗病原体入侵中具有重要作用。
目前,国外获得了MHCI与抗病有关的物种有大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)和沟鲶[35,36]等,而我国多是鉴定到MHCⅡ与抗病力连锁,如张玉喜等[37]发现了牙鲆(Paralichthysolivaceus)MHCⅡ与抗病力有关;徐建勇[38]发现MHCⅡB与大菱鲆(Scophthalmusmaximus)抗病有关;柴欣等[39]认为团头鲂(Megalobramaamblycephala)MHCⅡα基因的多态性与抗细菌性败血症性状显著关联,纯合基因型个体对嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病抗性更高。
抗菌肽基因是克隆较早的基因之一,1998年就克隆了鲶鱼的相关基因[40],近年来仍有很多关于鱼类抗菌肽基因克隆、遗传与生理机制的研究报道[41]。
鱼类干扰素的研究开展的也较早[42,43],1998年报道了牙鲆干扰素基因的克隆[44],2017年国内仍有多篇干扰素的研究报道[45-47],表现出人们对用干扰素来防治疾病仍寄以很大希望。
鱼类非特异性免疫相关基因的克隆与功能研究。
鱼类和其他多数水产养殖动物后天免疫或者有缺陷或者研究不够,至今没有获得如同哺乳类那么多的免疫球蛋白,疫苗开发的也不够好,因此,人们更关注先天免疫。
Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)是比较重要的先天免疫相关因子,编码TLR的基因是一个很大的家族,即TLR基因家族。
Gong等[48]对鲤全基因组筛查结果显示,鱼类的TLR基因家族较为庞大,许多基因与哺乳类相同,也有部分基因为鱼类特有,这些特有的基因和基因的高度多态性,允许研究者从中筛选出与抗病性相关的基因并用于抗病品种的选育。
范泽军等[49]的综述也表明鱼类TLR基因的结构复杂、多态性较高。
TLR基因同样受到我国研究者的重视,红鳍红方鲀、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、虹鳟、大西洋鲑(Salmosalar)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)、鲫(Carassiusauratus)等多种鱼类已经克隆了TLR基因[49],最近仍有很多TLR家族基因被克隆的报道,并开展了信号通路等功能研究,包括鲤、赤眼鳟(Squaliobarbuscurriculus)、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)、尼罗罗非鱼等[50-53]。
我国鱼类养殖成本的40~60%是饲料成本,提高饲料利用效率的经济价值巨大,但是饲料转化相关基因的研究报道很少。
从营养学角度探索提高饲料利用率的途径是很重要的方向,但依据基因功能选择高饲料转化效率的品种也应该是一种策略。
我国研究者开展了鲤饲料转化率与源于表达序列标签(expressedsequencetags,EST)的SSR标记的关联研究[54,55];Lu等[56]获得了18个饲料转化率性状的候选基因,其中IGFI也是鸡、牛和猪的饲料转化率显著相关的基因[57,58];张晓锋等[59]利用全基因组关联分析(genome-wideassociationstudies,GWAS)获得了17个鲤饲料转化率的候选基因,包括胰腺α淀粉酶等。
鱼类品质相关基因的研究。
我国水产养殖产量已远大于捕捞产量,一些大宗品种的产量已超出市场需求。
应对这个产业实际和国家提出的“供给侧”改革政策,淡水鱼类品质提升的品种改良被提到重要位置,相关基因的鉴定和育种潜力研究也受到科学家的关注。
鱼肉品质遗传改良的研究刚刚起步,根据几篇综述[60-62]分析构成鱼肉品质的几个方面如物理、化学和组织学指标以及一些风味物质,多数受营养、饲料和环境影响较大,依据现阶段的研究结果可以从基因角度进行探索的指标包括肌间刺、肌纤维、脂肪酸及相关酶类、鲜味氨基酸、肌苷酸等。
李远友等[63,64]克隆研究了多个鱼类的高度不饱和脂肪酸(highlyunsaturatedfattyacid,HUFA)合成通路上的关键酶基因;俞菊华及合作者[65-67]在脂肪酶合成方面对鲤的多个相关基因进行了克隆和研究;吴景等[68]克隆了鲤脂肪酸延长酶的基因;任晓亮等[69]鉴定到控制虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因,孙玉华等[70]克隆了鲤、鲫和鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)的谷胱甘肽转移酶基因;Ji等[71]分析了茶多酚对大黄鱼脂肪代谢相关基因组表达的影响。
鱼类品质相关基因克隆了很多,用于品种选育的研究也正在进行,但利用单个或几个基因育成品种未见报道。
由于品质性状与基因的关系非常复杂,利用基因及标记提高鱼类品质的选育确实是一个很大的也很有意义的挑战。
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1.3经济性状连锁的标记与主效QTL
目前,获得水产动物与性状连锁或者决定性状的基因/标记主要有三种策略,一是生物化学手段,如用基因转录产物来鉴定目标基因,1.2中介绍的基本上是使用这个技术路线;二是分子数量遗传学方法,包括连锁定位和关联分析尤其是GWAS;三是候选基因法。
遗传连锁分析是获得复杂性状以及未检测到生化产物的性状决定基因的重要手段,人类基因组计划中特别强调连锁图谱的价值也在于此[72]。
水产动物的经济性状多数是受多个微效基因控制的数量性状,不易找到性状的决定基因;很多质量性状也没有获得相关的生化产物,难以利用生化手段获得目标基因。
因此,利用分子数量遗传学方法获得性状相关标记或基因是较为有效的途径,即使质量性状和阈性状也可以用这种方法鉴定性状连锁的染色体区间进而鉴定相关基因。
Laghari等[73]总结水产养殖动物已开展了体色等6个质量性状、体质量等21个数量性状和抗病等6个阈性状的遗传连锁分析。
耐热可能是最早进行QTL研究的性状,1998年Jackson等[74]用微卫星标记分析了3个虹鳟家系的耐热性状,鉴定到2个微卫星标记与耐热相关。
数量性状中研究最多的是生长性状,虽然通过QTL研究最终会获得决定生长速度的基因,但是一方面生长性状现阶段不是多数水产养殖种急迫需要改进的性状,因为常规选育对生长的改良同样有效;另一方面,生长性状始终是选育品种必须要做好的性状,因为这是与养殖效益密切相关的,一般来讲,没有好的生长性状的品种是很难被养殖户认可的,除非有特别的市场需求。
品质的提升和饲料转化率的提高都是我国淡水鱼类需要改进的性状,与品质有关的脂肪含量连锁的QTL主要有大西洋鲑和鲤等的报道[75-78];饲料转化率前期报道较少,主要是有关鲤的研究结果,王宣朋等[79]鉴定到一批与镜鲤饲料转化率相关的QTL;Lu等[56]在比较镜鲤两个家系的QTL基础上利用全基因组资源,并通过比较基因组鉴定到18个与生长和代谢有关的基因,其中IGFI也是鸡、牛和猪的饲料转化率显著相关的基因;2017年Pang等[80]报道了鲫饲料转化率的QTL结果。
抗病性状具有较好的应用前景,我国水产养殖中鱼、虾病害比较严重,给产业造成了极大的损失,药物治疗和疫苗防治虽然都非常有效,但培育抗病品种也是一种有效途径。
日本东京海洋大学的Okamoto团队在抗病性状的QTL研究中成果突出,他们对虹鳟、香鱼(Plecoglossusaltivelis)、牙鲆等[81,82]抗病性状进行遗传定位,再用定位的标记进行品种选育,获得了养殖水平的抗病品种。
王志勇[2]认为该团队成功的关键是在研究中分别建立了抗病品系和易感病品系的雌核发育纯系,通过两者杂交再回交获得的子代抗病性能发生分离,使鉴定到的标记位点更为真实、准确。
我国学者在鱼类抗病QTL方面也做了大量研究,如Xu等[83]鉴定了牙鲆抗鳗弧菌(Vibrioanguillarum)病的QTL位点,贺艳[84]对美洲牡蛎(Crassostreavirginica)抗病性状进行了QTL等分析。
QTL研究有一个明显的不足是家系间共享的主效QTL比较少,这将限制其在选育种中的应用,例如Zheng等[85]在4个镜鲤家系定位到的67个生长相关的主效QTL中,未发现4个家系共享的QTL,仅发现1个为3个家系共享,14个为2个家系间共享,多数主效基因在另一个家系中是微效甚至无效的。
更为严重的是在同一个群体的不同发育阶段,主效QTL的差异也很大,譬如,Gutierrez等[86]发现大西洋鲑的5个家系在10、21、27、38月龄样本的体重主效QTL数量上差异很大(分别为26个、14个、21个、17个),这个团队将上述279个样本混合并加入192个新样本做GWAS分析,与生长显著相关的SNP只有1个,研究者认为混合样本中某些家系贡献小的等位基因稀释了其他家系该基因的显著效应[87]。
利用候选基因法获得基因是水产动物获得性状相关基因的重要途径,由于这类标记积累的越来越多,其应用价值也将越来越大。
这类基因标记有两个来源,一是同物种已鉴定的候选基因,二是不同物种同一性状的候选基因,这在先前的研究中已有很多例子,譬如李小慧等[88]利用候选基因法获得了与大口黑鲈生长紧密连锁的基因标记。
1.4经济性状的全基因组关联分析
在高通量分析技术出现之前,利用中等密度的图谱获得的QTL常被认为因精度不够而降低了准确性,群体间共享QTL少也多认为是因标记数量不足或样本过少而影响了重复度,科学家们希望高通量的标记可以解决这个难题。
但是,在进行了一些GWAS分析后,发现群体间共享标记少的现象仍然存在,人身高的GWAS结果提供了这样的案例,如2010年欧洲人身高的第一个GWAS结果,获得180个位点和相关的17个通路[89];2014年,Wood等[90]利用25万个样本较先前利用13万个样本所鉴定到的紧密连锁位点的数量提高3倍多(从180个到697个),相关的通路也增加近3倍(从17个到50个),表明与身高连锁的基因和所在通路与样本的遗传背景相关性非常大;又如Lei等[91]通过全基因组关联分析发现了13个与汉族人群身高显著相关的SNP位点,但在欧洲人群中却不显著。
以上研究结果表明GWAS与QTL相似,群体遗传背景对结果的影响非常大。
GWAS具有标记多可以全基因组范围仔细筛查与性状相关变异位点的优点[92],因此,更容易获得基因所在区域,也就更有可能获得决定性状的基因。
因此,该方法出现后,尤其是在二代测序技术使测序费用大幅降低后,很多生物学领域包括世界上投入基础研究较少的水产动物遗传育种领域也很快开展了研究,如刘占江、孙效文和Houston等所在团队分别建立了沟鲶、鲤和大西洋鲑的高通量SNP芯片作为开展GWAS研究的平台[93-95]。
由于测序价格下降,利用重测序开展GWAS分析可能是一个很实用的技术路线,Wan等[96]用GWAS分析了大黄鱼n-3HUFA和空壳重性状;Xu等[97]对雅罗鱼(Leuciscuswaleckii)的淡水种和耐高碱水种进行了比较分析,鉴定到一大批参与离子稳态、酸碱调节等高碱水适应变化有关的基因;Lamichhaney等[98]对大西洋和波罗的海不同区域的鲱群体进行重测序,判断出大西洋鲱(Clupeaharengus)不同群体的遗传分化主要来自各大地理群的地理适应;Hohenlohe等[99]利用GWAS结果和先前鉴定的基因位点发现了鳟鱼杂交群体具有来自候选的适应性超入侵等位基因;李雪[100]利用GWAS筛查了与虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)类胡萝卜素积累相关的基因和SNP位点,利用GWAS鉴定水产养殖动物经济性状相关基因的研究还有很多。
自GWAS出现以来,相关的技术创新也很多,其中我国科学家在这个学科的发展中做出了重要贡献,如Wang等[101]建立了基于2b-RAD高通量测序的基因型分型技术,不仅文章被广泛引用,其研究方法也被国内外很多研究者使用。
2水产动物分子标记辅助育种的研究进展
水产动物利用分子标记开展育种研究早在同工酶分析技术时代就有报道[102],但广泛开展分子标记辅助育种是在出现DNA分子标记之后,尤其是鉴定到足够的共显性分子标记之后才开始的。
2.1国外水产动物分子标记辅助育种研究进展
日本东京海洋大学Okamoto团队设计了一个非常有效的分子育种战略:
首先利用合作单位获得的对病原体的1个敏感品系和1个抗病品系建立杂交家系,进而与敏感家系或抗病家系回交作为QTL分析家系,开展抗病性状的QTL分析鉴定抗性位点,然后检测出抗病位点的纯合基因型个体作为亲本,与生长快的品系杂交,得到了几乎不染病的新品系。
该团队及合作者利用这个育种策略获得了牙鲆、虹鳟和香鱼抗病力强的具有生产规模的品系[103-105],这项工作被誉为水产分子标记辅助育种成功的范例。
利用基因/标记开展选育的报道很多,如Azis等[106]利用沟鲶具有抗嗜水气单胞菌特征的MHCI基因型开展了抗病品系的选育;Sae-Lim等[107]将虹鳟的生长、胴体重和存活率等性状综合在一起进行选育;Kobayashi等[108]依据基因型分析选育了卵径大、产卵早的虹鳟品系;Correa等[109]基于QTL定位结果开展了大西洋鲑抗海虱(Caligusrogercresseyi)新品系的选育;在国外,利用基因/标记的选育工作还涉及很多物种和很多性状[110-112],这里不再一一介绍。
用少数基因/标记获得突破性的育种结果很困难,人们寄希望于全基因组水平的标记,因此,全基因组选择育种成为近年来养殖动物的研究热点。
这项技术是挪威科学家Meuwissen在2001年[113]提出的基于基因组水平的遗传信息的育种方法,该文章发表后其技术被广泛地用于农业动植物育种研究,至目前已被引用1500多次。
这项技术用在奶牛育种中取得了使产奶量大增的突破性进展,但是其他性状进展不是特别明显。
正如Meuwissen等[114,115]的几篇综述中所表明的,这项技术在多个性状选育中都具有正效应,应用潜力巨大,但仍存在数量处理难度大、遗传增益较小等问题。
国外已有多个水产动物开展了基因组选择育种,Vallejo等[116]报道对于虹
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