分子生物学实验方法与步骤2.docx
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分子生物学实验方法与步骤2
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
一、原理
细菌体中含有大量蛋白质,具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色,可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量,可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备
1、30%储备胶溶液:
丙烯酰胺(Acr)29.0g,亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g,混匀后加ddH2O,37OC溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。
2、1.5MTris-HCl(pH8.0):
Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1MTris-HCl(pH6.8):
Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10%SDS:
电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶,浓盐酸调至pH7.2,定容至100ml。
5、10⨯电泳缓冲液(pH8.3):
Tris3.02g,甘氨酸18.8g,10%SDS10ml加ddH2O溶解,定容至100ml。
6、10%过硫酸铵(AP):
1gAP加ddH2O至10ml。
7、2⨯SDS电泳上样缓冲液:
1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml,β-巯基乙醇1.0ml,SDS0.6g,甘油2.0ml,0.1%溴酚兰1.0ml,ddH2O3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液:
考马斯亮兰0.25g,甲醇225ml,冰醋酸46ml,ddH2O225ml。
9、脱色液:
甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤
采用垂直式电泳槽装置
(一)聚丙烯酰胺凝胶的配制
1、 分离胶(10%)的配制:
ddH2O4.0ml
30%储备胶3.3ml
1.5MTris-HCl2.5ml
10%SDS0.1ml
10%AP0.1ml
取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED4μl,混匀后灌入玻璃板间,以水封顶,注意使液面平。
(凝胶完全聚合需30-60min)
2、 积层胶(4%)的配制:
ddH2O1.4ml
30%储备胶0.33ml
1MTris-HCl0.25ml
10%SDS0.02ml
10%AP0.02ml
TEMED2μl
将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间,完全聚合需15-30min。
(二)样品处理:
将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液,100℃加热3-5min,离心12000g×1min,取上清作SDS-PAGE分析,同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。
(三)上样:
取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
(三) 电泳:
在电泳槽中加入1⨯电泳缓冲液,连接电源,负极在上,正极在下,电泳时,积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需3hr)。
(四) 染色:
将胶从玻璃板中取出,考马斯亮兰染色液染色,室温4-6hr。
(五) 脱色:
将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。
(六) 凝胶摄像和保存:
在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像,结果存于软盘中,凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
三、注意事项
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果,缓冲液的pH值要准确,10%AP在一周内使用。
室温较低时,TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性,可通过皮肤和呼吸道吸收,应注意防护。
表达蛋白的分离与纯化
大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在,需要不同的纯化策略。
现在,许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能,这些自然需要将蛋白质分离出来后,进行进一步的研究来获得。
分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。
必须承认,蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的,尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性(因而它是唯一适合遗传物质的),但它却有标准的物理化学性质,而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质(因而它具有执行众多生物学功能的用途)。
正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。
所幸的是,尽管存在这种固有的困难,但现已有多种方法可以利用,蛋白质纯化策略也已实际可行。
目前,待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。
可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达(overexpression),表达水平可达细胞蛋白的2%以上,有些甚至高达50%。
一、可溶性产物的纯化(融合T7·Tag的表达蛋白)
(一)试剂准备
采用T7·TagAffinityPurificationKit
1.T7·Tag抗体琼脂。
2.B/W缓冲液:
4.29mMNa2HPO4,1.47mMKH2PO4,2.7mMKCl,3.0.137mMNaCl,1%吐温-20,pH7.3。
4.洗脱缓冲液:
0.1M柠檬酸,pH2.2。
5.中和缓冲液:
2MTris,pH10.4。
1. PEG20000。
(二)操作步骤
1.100ml含重组表达质粒的菌体诱导后,离心5000g×5min,弃上清,收获菌体,用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2.重悬液于冰上超声处理,直至样品不再粘稠,4℃离心14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3.将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起,平衡至室温,装入层析柱中。
4.B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5.10mlB/W缓冲液过柱,洗去未结合蛋白。
6.用5ml洗脱缓冲液过柱,每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集,混匀后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。
7.将洗脱下来的蛋白放入透析袋中,双蒸水透析24hr,中间换液数次。
8. 用PEG20000浓缩蛋白。
(三)注意事项
蛋白在过层析柱前,要0.45μm膜抽滤,否则几次纯化后,柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。
包涵体形成是比较复杂的,与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。
细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体,不具有生物学活性,因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解,释放出其中的蛋白质,并进行蛋白质的复性。
包涵体的主要成分就是表达产物,其可占据集体蛋白的40%~95%,此外,还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质,所以分离包涵体后,还要采用适当的方法(如色谱法)进行重组蛋白质的纯化。
(一)试剂配制
1.缓冲液A:
50mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl。
2.缓冲液B:
50mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA,100mMNaCl,1%NP-40。
3.缓冲液Ⅰ:
50mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100(V/V),4M脲素。
4.缓冲液Ⅱ:
50MTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl,3%TritonX-100。
1.缓冲液Ⅲ:
50mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,2M盐酸胍。
5.缓冲液C:
8M脲素,10mMβ-巯基乙醇,100mMTris-HCl(pH8.0),2mMEDTA及脱氧胆酸钠。
(二)操作步骤
1.用缓冲液A漂洗菌体细胞(10ml/g),离心6000g×15min,收集菌体细胞,重复此步骤,将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2.将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中,超声破碎,镜检,破碎率高于95%,离心1500g×30min,收集包涵体沉淀。
3.将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次,1500g离心收集包涵体沉淀。
4.包涵体的溶解:
用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min,然后离心1500g×30min,留上清。
将溶解后的蛋白质适当稀释,磁力搅拌,透析过夜。
5.溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
表达蛋白的生物学活性的检测
一、MTT比色法检测细胞活性
(一)原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷,其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。
对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
(二)试剂准备
1、 青链霉素溶液(100X):
青霉素100万U,链霉素100万U,溶于100mlddH2O中,抽滤除菌。
2、 L15基础培养基:
1000mlL15培养基,加2g碳酸氢钠,10ml100X青链霉素,5mlHEPES。
3、 MTT液:
5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、 SDS处理液:
20gSDS,50μl二甲基甲酰胺,加双蒸水50ml溶解。
5、 L-多聚赖氨酸:
50μg溶于1ml双蒸水中。
6、 L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
(三)操作步骤(以背根神经节细胞培养为例)
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节(DRG)。
2、镜下去除神经根和外膜,放入1ml0.1%胶原酶中37℃消化30min,每5min摇匀一次。
3、洗去胶原酶,吹打分散后,接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中,每孔含100μl无血清L15培养基,细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白(分别以不同的蛋白浓度),阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、37℃5%CO2培养48hr后,每孔加入10μlMTT,37℃5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl20%的SDS处理液,37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值,数据分析。
二、DRG无血清培养检测促神经生长作用
(一) 操作步骤:
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠DRG。
2、镜下去除神经根和外膜,接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中,每孔1个DRG。
3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基,实验组加入纯化的表达蛋白(分别以不同的蛋白浓度),阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。
4、37℃5%CO2培养,每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况,并进行测量,其数据作统计分析。
二、注意事项
1、MTT有毒,注意防护。
2、单个DRG贴壁实验操作难度较大,需仔细耐心。
放射性同位素标记的DNA序列测定分析
测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。
从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序,DNA测序技术发展很快。
目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。
Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。
它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。
其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板,合成出准确互补链,在合成时,某种dNTP换成了ddNTP,这时,DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物,使之掺入到寡核苷酸链的3’末端,导致3’末端无3'-OH,从而终止DNA链的生长,双脱氧核苷酸的种类不同,掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。
通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳,即可读出模板DNA的互补链序列。
一、试剂准备
1.硅化液:
四氯化碳250ml,二氯二甲基硅烷25ml。
2.6%变性PAGE胶的配制:
丙烯酰胺28.5g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g,10×TBE50ml,尿素210g,加ddH2O至500ml搅拌溶解,0.22μm滤膜过滤,4℃贮存于棕色瓶中。
使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵(25%)50μl,TEMED50μl,轻摇混匀,立即灌胶。
3.质粒DNA碱变性液:
NaOH2M,NaAc3M(pH4.8),无水乙醇,70%乙醇。
4.T7测序试剂盒。
二、操作步骤
1. 测序板硅化,流水、ddH2O洗,无水乙醇洗,晾干。
2. 灌胶:
装好测序板,玻璃板以15-30°角度倾斜放置,用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间,将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘,深约0.5-1cm。
夹好,将测序板放水平。
聚合约3hr后预电泳。
3. 预电泳:
按照说明要求安装好电泳装置,在上槽和下槽注入1×TBE。
设置温度50℃,功率100W,时间约30min。
(同时准备测序反应)
4. 质粒DNA双链碱变性:
DNA3-5μg溶于32μlddH2O中,加2NNaOH8μl,混匀,室温静置15min。
加3MNaAc7μl,无水乙醇120μl,混匀,-20℃放置30min。
离心12000g×15min,弃上清,70%乙醇500μl洗一次,离心12000g×7min。
弃上清,晾干沉淀,10μl灭菌ddH2O溶解。
5. 模板与引物复性:
加2μl测序引物、2μlAnnealingbuffer,混匀,稍稍离心,65℃温育5min,立即放置于37℃10min,室温5min以上。
6. 标记反应:
加3μllabelingmixture、1μl相应放射性同位素(10μCi)、2μlT7测序酶(使用前以稀释液1∶5稀释),混匀,离心,置37℃5min。
7. 预先准备四个0.5ml微量离心管,标上A、C、G、T,分别在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。
8. 链终止反应:
在A、C、G、T四个微量离心管中分别加入反应液4.5μl,37℃5min。
加入stopsolution5μl,短暂离心。
9. 上样:
关上预电泳电源,冲洗胶平面,将鲨鱼齿插入胶平面中约1-2mm形成加样孔。
将四个反应管置80℃2min。
立即取1.5-2μl加到加样孔上。
10.电泳:
50℃,100W,电泳2.5hr后,暂停电泳,在预留孔二次上样后,继续电泳2.5hr。
11.下胶:
停止电泳,取下测序板,倒掉电泳缓冲液。
拆开测序板,凝胶应粘在未硅化的的玻璃板上。
裁一张比胶稍大一些的滤纸,平铺在胶上,掀起滤纸,凝胶就被一起掀起。
12.压片:
将凝胶盖上保鲜膜,用monitor测读放射强度,以估计曝光时间。
在暗室中覆上X光片,置暗夹中,-70℃放射自显影。
13.洗片、读片:
取出暗夹,回到室温。
经D72显影、酸性定影液定影,水洗,晾干。
在X光片灯上读出序列。
三、注意事项
1. 测序板清洗、硅化的好坏直接影响灌胶及下胶。
处理不好时容易导致灌胶时气泡的产生,下胶时则易使电泳胶损坏。
2.灌胶时要避免胶的渗漏;注射器将凝胶灌到两块玻璃之间时,注意速度的控制,防止气泡的产生。
3.测序反应及电泳上样时要注意小心操作,防止放射性同位素污染,同时要加强整个后续实验过程中自身的防护。
4.规范、妥善处理放射性同位素接触物品及废弃物。
手工测序需要使用同位素,这给操作带来许多不便,对操作者也有一定的损害。
DNA测序仪的出现解决了这一问题,它不使用同位素标记,自动化程度高,测序效果好。
虽然DNA测序仪的价格目前仍比较高,但每次测序的花费并不算高,而且商品化服务也令人满意。
聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP)
聚合酶链反应-单链构象多态性分析(SingleStrandConformationPolymorphismAnalysisofPolymeraseChainReactionProducts,PCR-SSCP)是近年来发展起来的一种基因分析方法。
PCR-SSCP分析的基本程序为:
首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。
在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。
这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。
相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。
PCR产物变性后,单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常DNA区分开。
由此可见,PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果,现已发展多种PCR-SSCP技术,各有其优势及适用领域。
例如,可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷,也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。
这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。
在进行PCR扩增特定靶基因序列时,利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增,使扩增产物带有同位素标记物,然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影显示结果。
利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物,均可使产物信号增强几个数量级。
二者相比较,前者经济、扩增特异性强,多用于大样本的检测和筛选;后者操作简便,适于一般实验室开展,可用于小样本或大样本的检测和筛查。
本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。
一、试剂准备
⒈ PCR相关试剂
⒉ α-32P-dCTP
⒊ 30%聚丙烯酰胺(29:
1):
丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g,溶于100mlddH2O中,4OC保存。
⒋ 10%过硫酸胺配制方法:
1g过硫酸胺,溶于10mlddH2O中,4OC保存(可用数周)。
⒌ TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
⒍5×TBE缓冲液:
Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA(pH8.0)20ml,加ddH2O至1000ml。
7.变性上样液:
95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mMEDTA(pH8.0)
二、操作步骤
⒈PCR扩增
反应总体积为10μl,在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分:
10×buffer 1μl
dNTPmix 70μM
DNA模板100ng
引物及TaqDNA酶依实验设计要求按比例加入
α-32P-dCTP 0.1μl
加ddH2O至 10μl
按实验设计循环参数进行扩增,获取扩增产物。
⒉聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴电泳槽玻璃板的处理:
用洗涤剂清洗玻璃板,自来水反复冲净洗涤剂,双蒸水冲洗3次,晾干,95%乙醇擦拭,自然干燥。
用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上,5~10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。
在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐,用固定夹夹紧两块玻璃,并用玻璃胶带封边。
⑵制胶:
按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积,一般来讲使用5%~8%的凝胶较为合适。
轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气(开始时要缓慢)除气泡,加35μlTEMED至聚丙烯酰胺混合液中,混匀。
用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液,将玻璃模具倾斜成60O角,缓慢注入两玻璃板间的空隙中,直至灌满模具顶部。
立即插入相应的点样梳,(小心勿使梳齿下带进气泡,并且不要将梳齿全部插入胶内,留约2mm梳齿于玻璃板上端,以免拔梳时把胶孔拔断)。
由于凝胶在聚合过程中有回缩,所以应小心添加些胶液于梳子处,水平放置,室温聚合1hr。
将封口玻璃胶带掀去,放入电泳槽,凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽,用大号固定夹固定住两侧。
在上下电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液。
小心取出点样梳,用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
⑶扩增产物的处理:
将PCR扩增产物与变性上样液按1:
5的比例加入0.5ml 微量离心管中,混匀。
样品上胶前应98oC变性10min,立即冰浴骤冷。
取约3~5μl变性样品(根据点样孔的大小决定上样量),以微量加样器上样,(上样时要注意不要有气泡冲散样品,而且速度要快,时间长了样品易于扩散)。
⑷电泳:
电泳槽接上电极(上槽接负极,下槽接正极)开启电源,根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小,决定电泳的电压及电泳时间。
通常室温下以l~5V/cm电泳。
⑸剥胶:
电泳结束后,倒弃电泳缓冲液,取下电泳胶玻璃,用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃,凝胶应附着在一块玻璃上,切去凝胶左上角,作为点样顺序标记。
剪一张与玻璃同样大小的滤纸,严密覆盖于凝胶上,顺一个方向将凝胶缓慢取下,用保鲜膜盖于胶面并包好,避免膜和胶之间产生气泡或皱折,将凝胶固定在X线片夹中。
⑹放射自显影:
在暗室中将X线片贴于胶面,盖严片夹,用黑布将X线片夹包裹,置-70OC放射自显影。
曝光时间根据同位素的强度而定,约24h~10d。
⑺冲洗胶片从-70oC取出X线片夹,在暗室内迅速取出X线片,立即显影,以免使X线片上出现过多的冷凝水。
(如果想再得到一张放射自显影影像,可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。
如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温,并擦去冷凝水后再装入新的X线片)。
依次按以下程序操作进行显影:
X线片显影液显影1-5min
水洗lmin
定影液定影5min
流动水冲洗15min
所有使用液的温度应为18~20OC为宜。
三、注意事项
⒈核酸片段的大小:
用于SSCP分析的核酸片段越小,检测的敏感性越高。
对于<200bp的片段,SSCP可发现其中70%的变异;对于300bP左右的片段则只能发现其中50%的变异;而>500bp的片段,则仅能检出10%~3O%的变异,因此,<300bP,尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。
对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理,可以用限制性酶消化PCR产物,产生小于400bP的DNA片段,再进行SSCP分析。
⒉游离引物:
游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引物量为6nM都有明显影响。
因此,应尽可能除去游离引物。
可以采用不对称引物扩增方法,尽可能消耗多
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