药用野生稻愈伤组织诱导与分化探讨.docx
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药用野生稻愈伤组织诱导与分化探讨
药用野生稻愈伤组织诱导与分化探讨
目录
1.药用野生稻概述1
1.1药用野生稻的概念1
1.2药用野生稻简介2
1.2.1药用野生稻的价值2
1.2.2影响野生稻愈伤组织诱导的因素2
1.3药用野生稻愈伤组织的诱导及分化3
1.3.1目标定位3
1.3.2实际用途3
1.3.3生产意义3
2药用野生稻愈伤组织诱导条件3
2.1药用野生稻的生长条件3
2.2各种因素的影响3
2.3实验要求4
3实验设计4
3.1培养基类型4
3.1.1实验材料4
3.1.2实验目的5
3.1.3试验操作5
3.1.4结果记录及分析5
3.1.4.1四种不同培养基中生长结果记录5
3.1.4.2实验结果6
3.1.4.3四种不同培养基中生长结果分析........................6
3.1.4.4最适培养基类型分析..................................6
3.2生长调节剂的添加6
3.2.1实验材料6
3.2.2实验目的6
3.2.3生长调节剂的种类及作用6
3.2.4各种生长调节剂的理化性质7
3.2.5水稻的培养中生长调节剂的一般用量8
3.2.6试验操作9
3.2.7结果记录及分析9
3.2.7.1不同种激素添加结果记录9
3.2.7.2同种激素不同添加量结果记录9
3.2.7.3最适激素添加量综合分析10
3.3最适pH....................................................10
3.3.1实验材料..............................................10
3.3.2实验目的..............................................10
3.3.3pH对植物组织培养的影响................................10
3.3.4试验操作..............................................11
3.3.5结果记录及分析............................................11
3.3.5.1酸性条件下生长情况................................11
3.3.5.2不同pH条件下生长情况综合分析......................12
4.培养条件控制...........................................................12
4.1温度........................................................12
4.2湿度........................................................12
4.3光照........................................................12
4.3.1光周期..................................................13
4.3.2光照强度...............................................13
4.3.3光质...................................................13
4.4气体........................................................13
4.5试验操作....................................................13
4.6结果记录及分析..............................................14
5.野生稻愈伤组织诱导及分化.........................................14
5.1实验材料....................................................14
5.2实验目的....................................................14
5.3试验操作....................................................15
5.3.1愈伤组织的诱导.........................................15
5.3.2芽的诱导...............................................15
5.3.3幼苗的长成.............................................15
5.3.4幼苗生根...............................................15
5.3.5完整植株...............................................15
5.3.6炼苗...................................................15
5.3.7实验结果...............................................15
6.结论..............................................................16
7.药用野生稻的展望..................................................16
参考文献..........................................................17
药用野生稻愈伤组织诱导与分化探讨
摘要:
云南药用野生稻是我国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库。
本文旨在以云南特有的药用野生稻为材料,以常规培养基为基础,探索适合野生水稻生长的培养条件(培养基类型、培养基成分、生长调节剂的添加量、最适pH等)。
在其基础上诱导野生稻的生长及分化,得到野生稻的愈伤组织,然后将愈伤组织进一步进行脱分化进行培养,有望得到野生稻的植株,作为种质资源进行研究。
关键词:
药用野生稻;愈伤组织;诱导;分化
Abstract:
YunnanO.officinalisWall.exWatt.isourmostvaluableresourcesofwildrice,it,asavaluablegenepool,hasmanygoodtraitsandfavorablegenesabletobemodifiedtothenewvarietiesofcultivatedrice.Theaimtothisstudyistoexplorethewildricegrowthconditions(mediumtype,mediumcomposition,theadditionofgrowthofragulators,pH,etc.).BasedontheirgrowthandinduceddifferentiationofO.officinalisWall.exWatt.,wildricecalluswereobtained,andthenfurtherde-differentiationofcallusculturedplantswereexpectedasexcellentgermplasmmatierals.
Keywords:
O.officinalisWall.exWatt.,callus,induction,differentiation
1.药用野生稻概述
云南药用野生稻是我国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库。
野生稻不仅是珍贵的野生植物资源,而且蕴藏着十分丰富的优良种质基因,是改良栽培稻,可供人类长期持续发掘利用的重要基因宝库。
目前,水稻育种面临许多困难,抗逆、高产、优质等许多方面都有待改进。
所以,水稻育种问题变得尤为重要。
1.1药用野生稻的概念
云南药用野生稻是我国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库。
其具有特殊的CC基因组优良基因,为野生稻的研究、育种提供了良好的条件。
禾本科植物,分布于广东、广西、云南,为渐危种。
本种在我国南部有零星分布,染色体组为cc型,为二倍体植物,作为栽培稻的野生近缘种质基因而需加以保护。
多年生草本,杆直立或下部匍匐,高1.5一3米,直径7一10毫米,具8一15节,基部2一3节上生发达的不定根。
叶鞘长达40厘米,大多比节间长3倍以上,无毛;叶舌膜质,长约4毫米,无毛;叶耳不明显;叶片宽大,线状披针形,长30-80厘米,宽20一30毫米,质地较厚,先端尖,基部渐窄呈柄状,中脉粗壮,侧脉不明显,下面糙涩,上面散生长柔毛,基部贴生微毛,边缘具锯齿状粗糙。
圆锥花序大型疏散,长30-50厘米,分枝长10-15厘米,3一5枚着生于各节,具细毛状粗糙,下部长、裸露、腋问生长毛;小穗柄长1-4毫米,粗糙,顶端具2枚半月形退化颖片;小穗长约5毫米,宽约2.5毫米,厚13毫米,黄绿色或带褐黑色,成熟时易脱落;不孕外粹线状披针形,长1.6-2毫米,顶端渐尖,具1脉、边缘有细纤毛,成熟花外稃阔卵形,脉纹增厚隆起,脊上部或边脉生疣基硬毛,脉间下陷,散生短硬毛,表面具较粗的疣状突起,其在每侧排成24-26纵行;芒自外样顶端伸出,长5一10毫米,具细毛;内稃与外稃同质,宽约为外稃之半,脊疏生疣基硬毛,顶端有小尖头,边缘干膜质;花药长约2.5毫米。
颖果扁平,红褐色,长约3.2毫米,宽约2毫米。
1.2药用野生稻简介
禾本科植物,分布于广东、广西、云南,为渐危种。
本种在我国南部有零星分布,染色体组为cc型,为二倍体植物,作为栽培稻的野生近缘种质基因而需加以保护。
多年生草本,杆直立或下部匍匐,高1.5一3米,直径7一10毫米,具8一15节,基部2一3节上生发达的不定根。
叶鞘长达40厘米,大多比节间长3倍以上,无毛;叶舌膜质,长约4毫米,无毛;叶耳不明显;叶片宽大,线状披针形,长30-80厘米,宽20一30毫米,质地较厚,先端尖,基部渐窄呈柄状,中脉粗壮,侧脉不明显,下面糙涩,上面散生长柔毛,基部贴生微毛,边缘具锯齿状粗糙。
圆锥花序大型疏散,长30-50厘米,分枝长10-15厘米,3一5枚着生于各节,具细毛状粗糙,下部长、裸露、腋问生长毛;小穗柄长1-4毫米,粗糙,顶端具2枚半月形退化颖片;小穗长约5毫米,宽约2.5毫米,厚13毫米,黄绿色或带褐黑色,成熟时易脱落;不孕外粹线状披针形,长1.6-2毫米,顶端渐尖,具1脉、边缘有细纤毛,成熟花外稃阔卵形,脉纹增厚隆起,脊上部或边脉生疣基硬毛,脉间下陷,散生短硬毛,表面具较粗的疣状突起,其在每侧排成24-26纵行;芒自外样顶端伸出,长5一10毫米,具细毛;内稃与外稃同质,宽约为外稃之半,脊疏生疣基硬毛,顶端有小尖头,边缘干膜质;花药长约2.5毫米。
颖果扁平,红褐色,长约3.2毫米,宽约2毫米。
1.2.1药用野生稻的价值
云南药用野生稻是珍贵的野生植物资源,蕴藏着十分丰富的优良种质基因,是改良栽培稻,可供人类长期持续发掘利用的重要基因宝库。
药用野生稻主要遗传特性和有关基因(片段),对野生稻资源的保存、研究和利用,具有重要的理论和实际意义。
1.2.2影响野生稻愈伤组织诱导的因素
在药用野生稻愈伤组织诱导的过程中,既受到内部因素的影响,也受到外部因素的影响。
其中,内部因素包括:
培养基类型、植物生长调节剂、pH等。
外部因素有:
温度、湿度、光照、气体。
1.3药用野生稻愈伤组织的诱导及分化
1.3.1目标定位
为了更好的利用药用野生稻这个资源,在本试验中,着重探究药用野生稻培养基的配方、确定生长调节剂的添加种类及最适量、探究培养基最适pH、愈伤组织培养过程中的条件控制,以培养出优质的药用野生稻植株,作为种质资源进行研究。
1.3.2实际用途
药用野生稻具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库,一般用于水稻育种、抗性的研究。
其具有特殊的CC基因组,虽然很难通过有性杂交转移到栽培稻(AA基因组)上,但是有望以大片段形式通过BIBAC(binarybacterialartificialchromosome,BIBAC)等载体转化到栽培稻中。
BIBAC载体作为第三代新型载体,不仅能够作为大片段基因组文库的载体,而且能够通过根癌农杆菌介导将克隆片段直接导入植物基因组实现转化,成为目前植物基因克隆和转化的有效工具之一。
1.3.3生产意义
随着水稻育种问题日益突出,野生稻的利用越来越广泛,若可以实现野生稻植株的大量栽培,这对水稻的研究将起到不可估量的作用。
2药用野生稻愈伤组织诱导条件
2.1药用野生稻的生长条件
生长于海拔400~1100m的地区,分布在丘陵山地和山坡中下部的冲积地和沟边。
为喜温暖、多雨、潮湿的短日照植物,生于丘陵林地环境,适宜在荫蔽、腐殖质丰富、pH值为6左右的肥沃沙壤土上生长。
伴生植物有薏苡CoixlacrymajobiL.,棕叶狗尾草Setariapalmifolia(Koen.)Stapf,蕨类等。
在较大的河流、池塘、沟渠有较深水层和无阴蔽处均不宜于生长,因而有别于稻和普通野生稻。
2.2各种因素的影响
培养基类型、培养基成分、生长调节剂的添加量、pH、外部因素等。
2.3实验要求
在实验室中进行该实验,操作过程在无菌条件下进行,控制各种因素,使药用愈伤组织达到最理想的生长状态。
若培养基营养殆尽,应及时更换培养基,使愈伤组织一直处在最佳生长状态。
3实验设计
为更有效地改善目前药用野生稻愈伤组织的诱导及分化现状,探究一种更好的培养方式,提高药用野生稻品质,为药用野生稻的研究提供更好的种质资源。
3.1培养基类型
目前,已公开报道的基础培养基种类较多,为使用者提供了广泛的选择机会。
要综合考虑外植体材料的种类、器官类型和培养目的,有针对的选择适宜的培养基,没有任何一种培养基可适合所有情况下的组织培养。
组织培养实践中常用的培养基简介如下。
(1)MS培养基1962年由Marashige和Skoog为培养烟草组织而设计的,是应用最为广泛的培养基,其特点是无机盐含量高,特别是硝酸盐和铵盐含量高,可满足植物组织生长发育对营养元素的要求,但其不适合生长速度较慢、对无机盐浓度低的植物培养物。
在使用中,可将MS培养基的大量元素减到原来的1/2、1/3、1/4,以降低无机盐的含量。
(2)B5培养基是1968年由Gamborg等为大豆组织而设计的。
其主要特点是含有较低的铵,因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。
应用表明,有些植物在B5培养基上培养更为适宜,如双子叶植物,特别是木本植物。
(3)White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。
1963年又作了改良,称为White改良培养基,提高了MgSO4的浓度并增加了硼素。
其特点是无机盐含量较低,适于生根培养。
(4)N6培养基是1974年中国科学院植物研究所朱至清等为水稻等禾谷类植物花药培养而设计的。
其特点是成分较简单,KNO3和(NH4)2SO4含量高。
在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他禾谷类植物的花药、细胞及原生质体培养。
3.1.1实验材料
药用野生稻愈伤组织、培养基所需的各种基本成分(大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、生长调节剂)。
3.1.2实验目的
为更有效地改善目前药用野生稻愈伤组织的诱导及分化现状,摸索一种更好的药用野生稻培养基类型。
3.1.3试验操作
将较少量刚诱导出来的药用野生稻愈伤组织接入不同种类的培养基中进行培养,根据试验结果选出最适培养基。
或根据实验自身特点,改良传统培养基,找出药用野生稻的最适培养基。
3.1.4结果记录及分析
将药用野生稻愈伤组织在不同培养基中的生长情况进行统计、分析,从而得出结论。
3.1.4.1四种不同培养基中生长结果记录
愈伤组织生长状况
MS
培养基
经过一段时间的培养,愈伤组织生长旺盛,长势最好。
愈伤组织由刚接种时只具少量、颜色较浅的愈伤组织转变为大量的、乳白色团状结构。
大量团状结构聚生在一起,结构紧密、饱满。
White培养基
经过一段时间的培养,愈伤组织生长情况较差,长势不好。
愈伤组织由刚接种时的少量白色粒状结构生长为少量的、乳白色小团状结构,结构疏松。
B5
培养基
经过一段时间的培养,愈伤组织生长旺盛,长势一般。
愈伤组织由刚接种时只具少量、颜色较浅的愈伤组织转变为乳白色团状结构。
大量团状结构聚生在一起,结构紧密。
N6
培养基
经过一段时间的培养,愈伤组织生长旺盛,长势较好好。
愈伤组织由刚接种时只具少量、颜色较浅的愈伤组织转变为大量的、乳白色团状结构。
大量团状结构聚生在一起,结构紧密,但愈伤组织不及MS培养基中的饱满。
3.1.4.2实验结果
3.1.4.3四种不同培养基中生长结果分析
由上表可以看出:
药用野生稻愈伤组织在MS培养基中长势最好,愈伤组织转变为大量的、乳白色团状结构。
大量团状结构聚生在一起,结构紧密、饱满。
此外,在N6培养基中长势较好,但不及在MS培养基中的生长状况。
在B5和White培养基中长势一般,可能是由于这两种培养基中无机盐含量低于其所需的量,所以长势不好。
3.1.4.4最适培养基类型分析
经过一系列的实验,可以看出:
在MS培养基中药用野生稻愈伤组织生长得最好,因为MS培养基所提供的营养物质最符合药用野生稻愈伤组织生长所需,所以MS培养基是培养药用野生稻愈伤组织的最适培养基。
3.2生长调节剂的添加
在培养基中,生长调节剂用量虽然微小,但不可缺少。
使用不同种类,不同浓度和不同比例关系的植物生长调节剂,可以调节培养物的生长发育进程、分化方向和器官发生。
3.2.1实验材料
药用野生稻愈伤组织、各种生长调节剂。
3.2.2实验目的
在其他条件都一致的前提下,在培养基中加入不同的生调节剂,观察其生长
状况,摸索药用野生稻培养过程中所需的生长调节剂类型及用量。
3.2.3生长调节剂种类及作用
由于植物体内的植物激素含量极低,提取非常困难,限制了它的应用。
人们就用化学方法合成并筛选出许多具有植物激素生理活性的有机化合物,这些人工合成的、具有植物激素活性的物质被称为植物生长调节剂。
至今已合成了数百种植物生长调节剂。
根据生理功能的不同,将植物生长调节剂分为三类:
植物生长促进剂、植物生长抑制剂和植物生长延缓剂。
也有人根据植物激素的相似性质,将植物生长调节剂分为划分为九类:
分别是生长素及相关化合物、赤霉素类、细胞分裂素及其相关化合物、乙烯及相关化合物、生长抑制剂类、生长延缓剂类、油菜素内酯、复合型调节剂和其他。
植物生长促进剂是指具有促进植物细胞分裂、分化和延长作用的生长调节剂。
可以促进植物营养器官的生长和生殖器官的发育。
生长素类、赤霉素类、油菜素内酯等都是植物生长促进剂。
例如,生长素类的吲哚乙酸可以促进插条生根,在生产上广泛应用。
又如2,4-D在低浓度下(1~2毫克/升)可诱导组织培养中愈伤组织、胚状体的产生;中等浓度可防止落花落果,诱导产生无籽果实和果实保鲜等;高浓度下(大于10毫克/升)又可作为除草剂杀死多种杂草。
植物生长抑制剂是指能够抑制植物茎顶端的分生组织细胞生长的一类化合物。
常用的植物生长抑制剂有脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯、三点苯甲酸、整形素等。
例如,在生产上,桃树开花后3周左右,新梢长到10-20厘米时喷施浓度为50-70毫克/升的整形素等,徒长的新梢可以得到控制、分支和发芽,并使花芽饱满。
对于这些植株喷施生长素类溶液可以消除生长抑制剂产生的效应,证明是由于生长素的作用引起的反应。
用赤霉素等处理不能减弱或逆转生长抑制剂产生的抑制效果。
植物生长延缓剂是一大类能够抑制植物茎部近顶端分生组织生长的化合物,如:
多效唑、优康唑(S-3307)、矮壮素等,它们大多具有阻抗赤霉素的作用,有些抑制植物体内赤霉素的生物合成,如矮壮素、多效唑等。
它们使植物节间缩短,叶数和节数不变,株型紧凑,矮小,生殖器官不受影响或影响不大。
经生长缓释剂处理的植物表现出矮化,用赤霉素处理后,植株茎可以恢复正常,接近对照植株。
3.2.4各种生长调节剂的理化性质
植物生长调节剂名称
相对分子质量
理化性质
缩写
中文名称
IAA
吲哚乙酸
175.19
无色结晶,见光易分解,熔点164~165℃,微溶于水,易溶于乙醇、乙醚和丙酮。
在碱性溶液中比较稳定
NAA
萘乙酸
186.2
无色针状结晶,熔点134.5~135.5℃,易溶于乙醇、乙醚和丙酮等。
微溶于热水,易潮解和见光易变色
IBA
吲哚丁酸
203.2
白色或微黄色结晶。
稍有异臭,熔点为123~125℃,不溶于水,能溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂
6-BA(BA)
苄氨基嘌呤
225.2
白色针状结晶,熔点230~232℃,难溶于水,可溶于酸性溶液或碱性溶液。
在酸碱溶液中稳定
KT
糠氨基嘌(激动素、动力精)
215.2
白色固体,熔点265~266℃,能溶于强酸、碱溶液及水溶液,不溶于水
CPPU
247.68
白色结晶性粉末,熔点171℃,难溶于水,易溶于乙醇、丙酮
ABA
脱落酸
264
无色结晶,熔点为160~161℃,难溶于水,可溶于甲醇、乙醇等
GA
赤霉素
364
白色结晶,工业品为白色粉末,熔点233~237℃,难溶于水,不溶于苯和氯仿等,溶于乙醇
2,4-D
2,4-滴
221.04
白色结晶,熔点141℃,难溶于水,能溶于乙醇、乙醚、丙酮、碱或盐溶液,易溶于水
3.2.5水稻的培养中生长调节剂的一般用量
水稻(Oryzasativa)是世界上重要的粮食作物,从20世纪60年代开始就有大量组织培养的报道。
经过近50年得发展,植株的任何部分(花药、花粉、子房、胚乳、胚芽等性器官以及根尖、分蘖、穗、叶等体细胞组织)都能诱导愈伤组织并获得再生植株。
植物和细胞培养为进行突变体筛选和细胞转化、基因工程打下基础。
(1.)无菌种子萌发培养:
无菌种子萌发→诱导愈伤组织→愈伤组织继代培养→诱导不定芽→诱导生根→完整植株
诱导愈伤组织培养基:
MS+2,4-D2.0mg/l+蔗糖4.5%
愈伤组织继代培养培养基:
N6+2,4-D2.0mg/l+蔗糖5.0%
诱导不定芽培养基:
MS+KT(2~5)mg/l+IAA0.5mg/l
诱导生根培养基:
MS+多效唑2.5mg/l
培养基pH5.7
(2.)叶培养
4~6
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