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植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展
刘茂炎
摘要:
随着现代技术的发展特别是分子技术的发展,鉴定和检测病毒的方法越来越多,也越来越精确快速。
以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定,其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的;于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。
不论怎样的方法技术,都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。
在此基础上,甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。
本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。
关键词:
植物病毒;检测技术;PCR
病毒在生物学上特征(如病毒的理化性质,包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等)以及在寄主上的反应(如寄主范围、症状表现、传播方式等)是对病毒最直观的认识。
常规的对植物病毒的鉴定检测方法有:
生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。
生物学测定依据病毒的侵染性,观察寄主植株或其它生物的症状表现;血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础;电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同;分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。
1.生物学鉴定
最直接的方法是目测法,直接观察病毒对植物的病害症状。
如烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV),病害症状为叶上出现花叶症状,生长陷于不良状态,叶常呈畸形;玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。
目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。
1929年美国病毒学家霍姆斯(Holmes)用感病的植物叶片粗提液接种指示植物,2~3天后接种叶片出现圆形枯斑,枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比,能测出病毒的相对侵染力,对病毒的定性有着重要的意义,这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。
国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarffijivirus,RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物,该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphaxstriatella),玉米是灰飞虱的桥梁寄主而非最适寄主[2],以玉米作为指示植物可以良好地鉴定RBSDV。
目前接种鉴定的方法主要有四种:
粉風接种鉴定、嫁接接种鉴定、农杆菌接种鉴定、基因枪轰击法接种鉴定(叶青静等,2009)。
后两种鉴定方法涉及到了分子克隆技术,是传统方法与基因工程技术的结合。
用农杆菌接种法将番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirusdisease,TYLCD)导入叶盘和整个植株,TYLCV在植株中进行系统侵染,诱导致病症状,同时此法还可以用来筛选抗TYLCV的植株[3]。
2.免疫-血清检测方法
2.1.血清学检测法
目前血清学技术依然是植物病毒病原检测中最常用的方法之一,它是上世纪世纪六七十年代诞生的病毒检测技术,此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为核蛋白的特性而设计的,利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体,从而进行病毒的定性定量分析。
其中重要的一些方法有:
补体结合测定法(补体能在抗体存在的情况下通过补体的酶作用溶解红细胞和革兰氏阴性菌)、沉淀法(不同病毒类型在电解质存在时抗体与同源抗原相互结合形成的沉淀也不同)等。
利用基因工程的方法从大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)中高效表达病毒的外壳蛋白,纯化表达产物制备抗血清具有特异性强的特点,可弥补常规方法的不足[4]。
2.2.酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附实验(ELISA)也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理,只是在抗体上附带了酶标记,从而使反应可以有颜色强弱的变化,利于定时定量监测病毒浓度。
此法灵敏度高,且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰。
ELISA基本类型主要有间接法(I-ELISA)和直接法(DAS-ELISA也叫双抗体夹心ELISA)[5]、三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)等(Accottoetal.,2000;Accotto&Noris,2007;孙伟等,2002)。
其中TAS-ELISA是检测TYLCV常用和有效的手段之一。
1976年Voller等首次将ELISA方法用于检测植物病毒,Clark和Adams等[6]在1977年首次对植物病毒病原利用酶联免疫法进行了鉴定。
ELISA方法可以检测出0.1~10ng/mL的病毒,特异性很强、操作简单、简便有效,国内外已研发出许多商品化的ELISA试剂盒[7-10]。
因此,在植物病毒检测中ELISA技术也广泛地应用于病毒病的鉴定和进出口检疫上。
这种酶联免疫吸附测定(ELISA)是结合了酶的高效催化作用和抗原抗体的免疫反应,酶与抗体通过化学方法相结合而形成酶标抗体,酶标记抗体直接与包被在固体支持物上的待测抗原或抗体特异性结合或通过免疫桥特异性结合,再在酶的作用下使底物产生有颜色或高电子密度的可溶性产物,结果通过肉眼或比色法来进行定性的测定,从而得到抗体的性质和数量。
2.3.基于酶联免疫吸附法的新技术
2.3.1组织印迹法
此方法包括斑点免疫结合测定法(DIBA-ELISA或dot-ELISA)、直接组织斑点免疫测定(IDDTB-ELISA)等[11]。
这些技术直接将组织印迹在膜上,不仅保持了ELISA的灵敏性和特异性等特点,而且简化了操作程序,使病毒检测更加快速、简单、方便,且印迹在硝酸纤维膜上的样品保存时间较长,检测结果能直观地显示出病毒感染的部位,适用于植物病毒的大规模普查。
2.3.2免疫毛细管区带电泳技术
免疫技术与电泳技术结合发展出了免疫毛细管区带电泳技术(ImmunoCapillaryZoneElectrophoresis,I-CZE)。
I-CZE将血清学反应的专化性和毛细管区带电泳的灵敏、快速、可自动检测等特点结合起来,实时检测抗原-抗体复合体,I-CZE可快速分析多个样品,因而在苗木带毒检测、植物检疫等方面可发挥巨大作用,有广阔的应用前景。
2.3.3免疫PCR技术
免疫技术与PCR技术结合发展出了免疫PCR技术(I-PCR或IC-PCR)。
免疫PCR是一种将抗原抗体反应的高特异性与PCR的高灵敏度有机结合的检测技术。
该技术先用抗体来捕获病毒,提取核酸后,再进行PCR或RT-PCR检测。
将PCR技术和抗原抗体反应相结合,灵敏性非常高。
因其对一个分子的抗原都可以进行检测而具有十分广泛的应用前景,是一种用于检测微量抗原的PCR技术。
该方法由于能去除抑制物质而改善检测环境,比标准PCR方法更为灵敏、可靠。
G.Harper应用IC-PCR检测到香蕉条纹病毒[12]。
此外还有快速免疫滤纸法、免疫胶体金技术、免疫沉淀法、免疫电镜、荧光免疫、放射免疫和Ig指示试纸法等[13]。
3.显微成像技术
病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。
对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒,可直接从感染组织或分泌液,或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查,直接观察病毒粒子。
目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能够诊断和鉴别植物病毒,一般可诊断到属的水平。
在植物病毒的诊断和形态鉴别中,最有用的特征是病毒粒子的形态结构和寄主病变,有些细胞病变特征还能用于区分不同的病毒种甚至株系。
3.1超薄切片法和负染法
超薄切片法其优点是可观察病毒形态和形态发生过程,缺点是操作复杂,费时,但标本可长时间保存;负染法是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度,使样品显示负的反差,衬托出样品的形态和大小,其优点是快速简易(10-20min)、分辨率高,缺点是敏感性低,要求病毒量在107以上,且所有样品应处于悬浮状态;T.Hatta等用负染和超薄切片电镜观察区分了CMV的6个不同株系[14]。
3.2免疫吸附电镜技术
1973年,K.S.Derrick把电镜与免疫学技术结合,发明了更为灵敏的免疫吸附电镜技术,该技术现已成为植物病毒研究的一个重要手段[15]。
免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物,在电镜制样过程中病毒颗粒不能集中的沉积在有效的电镜视野内,而容易造成电镜观察时的疏漏,免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和性与吸附性的这一特点,在电镜制样过程中,于铜网上先铺展一层细胞色素A,稍后再添加一滴抗体,多余液滴用滤纸吸掉,最后点上一滴抗原和染液,由于细胞色素A的作用,减少了样品即抗体、抗原的表面能力,能形成均匀的涂层,再加抗体、抗原的吸附作用使病毒能较集中地沉集在有效视野内,从而便于电镜下的观察,大大提高了检测几率。
D.Louro等于1984年在此基础上建立了悬浮样品的胶体金标记免疫修饰法[16](也就是上述第二点免疫法中的免疫胶体金技术)。
此方法利用一抗对病毒进行免疫修饰,再用胶体金标记二抗或蛋白A处理,形成病毒"抗体"金颗粒免疫复合物。
由于在病毒表面的抗体“晕圈”上结合了直径5~10nm的金颗粒,该复合物的电镜下的可见性好,比单纯免疫修饰法更易判断。
3.3低温电镜技术以及一些局限性显微检测技术
低温电镜技术,结合了电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术,其不但有分辨率高的优点,而且对病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小,常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测[17]。
X-射线衍射技术,通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构,但为了保证衍射图像的准确性,往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高,所以这种技术的使用范围相对受限。
核磁共振技术,对比前面提到的技术对操作的要求更低,运用范围也更广,但是对结构的准确性判断略低。
此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究。
4.分子生物学检测方法
寄生于宿主细胞的病毒有不同于宿主细胞的特异基因组序列,这是病毒的存在的证明。
分子生物学检测法就是通过检测病毒核酸(DNA、RNA)来鉴定病毒的存在,由于是建立在核酸水平上,所以相对于血清学检测法有更高的灵敏度(Piccotbetal,1999),并且有更强的特异性,更广的检测范围,还可以进行大批量的样本检测,甚至可以使用粗提液检测病毒。
在植物病毒鉴定检测方面,目前应用的分子生物学技术主要有核酸斑点杂交(NucleicAcidSpotHy-bridization,NASH)技术、多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术、dsRNA电泳技术等[18]。
4.1.核酸分子杂交技术(NucleicAcidHybridization)
核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的,它是以DNA分子碱基互补配为理论依据,与待测样品的DNA或RNA用特异性的核酸探针形成杂交分子[19-20]。
采用带有放射性或非放射性物质标记的已知序列核酸单链作为探针,在一定条件下与靶病毒的核酸单链退火形成杂交双链。
通过检测杂交信号,检测出样本中病毒的基因组份。
其优点是可检测同种病毒的不同株系,还可检测类病毒、卫星RNA以及某些不能形成病毒粒体蛋白的病毒分离物;缺点是同位素标记有放射性污染。
但是非同位素标记不会造成环境污染,而且在信号放大和模板扩增上有所发展,并在灵敏性上也有完善和提高。
生物素、地高辛和荧光素是常用的非同位素标记物[21]。
对于DNA病毒、RNA病毒及类病毒的检测采用核酸杂交技术,不仅敏感性高,而且特异性强[22-23]。
结合PCR和NASH,出现了PCR微量板杂交技术,其灵敏度是ELISA的1万倍,特异性比普通PCR强。
王明霞成功应用该技术检测了马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)[24]。
以此为基础,还发展出了荧光原位杂交技术(Fluorescentinsituhybridization,FISH),它是用特异性的核酸重复序列作为探针,用一定方法将其进行荧光标记,然后与被测目标进行杂交,通过荧光显微镜下可以观察到特异的荧光信号,从而对其进行分析处理。
该技术能准确检测和定位一些基因组可以整合到寄主基因组的植物病毒。
G.Harper等应用该技术将香蕉条纹病毒基因整合到香蕉基因组上,这是植物病毒检测方面的又一重大突破[25]。
王金平等[26]对小滨麦易位系小麦山农0096进行抗条锈病基因的定位研究,将导入的抗条锈病基因定位在了4A染色体上。
4.2.聚合酶链式反应技术(PolymeraseChainReaction,PCR)
聚合酶链式反应(PCR)其原理即利用DNA半保留复制的特性,以原始DNA为模板合成两条一样的双链,从而达到指数量扩增,DNA总量可检测的目的。
另外,由于病毒的核酸有的是DNA,有的是RNA,所以常规的PCR以及反转录PCR即可针对不同的病毒基因进行检测。
PCR技术在病毒病原检测中具有强大的灵敏性,最低可检测的病毒含量为fg水平的病毒,比酶联免疫法高出1000倍[27]。
在此基础上衍生了越来越多的PCR方法。
4.2.1.复合RT-PCR(多重PCR)
此种PCR方法是在同一RT-PCR反应体系中同时使用几对引物扩增多个目的基因片段同时检测多个病毒。
4.2.2.实时荧光RT-PCR
将RT-PCR和荧光技术相结合,与传统PCR基本相同,只是在体系中加入荧光基团,反应中利用CCD实时读取荧光信号,检测。
不仅减少的污染和浪费,也使定量快速而方便,可以实现多样品和高通量的反应。
实时荧光RT-PCR还可避免假阳性的出现。
国内外学者运用该项技术检测植物病毒[28,29]。
4.2.3.定量PCR
PCR扩增在某一特定扩增时期,扩增产物是呈指数增长的,最终PCR产物与模板量是直接相关的,模板定量PCR就是利用这一特点进行。
PCR定量关键是选择好扩增呈指数增长的最佳时机和内部设置扩增模板对照。
PCR定量技术的产生使RNA定量所需模板量在极少的情况下也能进行。
4.2.4.原位PCR
原位PCR结合了原为杂交技术和PCR技术,用于检测低拷贝的RNA和DNA,同时,可以用于确定细胞来源并进行特异性的细胞内定位。
4.2.5.巢式PCR
巢式PCR也称套式PCR(nestedPCR),设计两套引物,先用第一套引物扩增15-30个循环,再用设定好的第二套引物对第一次扩增的DNA片段继续扩增15-30个循环,比普通PCR技术有更好的特异性。
它可用于检测微量的DNA,尤其适用于单拷贝基因的扩增和微量的生物检测。
除以上几种还有免疫PCR(在上述免疫法中已概述)、PCR-ELISA(用ELISA代替琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物)、生物素化引物模板捕捉PCR技术、转录扩增PCR技术(TAS-PCR)、半保留式复制PCR技术(3SR-PCR)、滚环扩增技术(rollingcycleamplification,RCA)(可对未知病毒序列进行扩增,使用该方法可以检测到含量较低的DNA–B及DNAβ分子,以及复合侵染中处于劣势地位的病毒)。
4.2.6.序列非依赖性基因体外扩增技术
上述PCR方法不适用于对于未知序列的病毒的鉴定检测,序列非依赖性基因体外扩增技术可以直接侦测未知的病毒,并且不需要预知病毒的基因序列[30]。
目前主要发展出来的方法有:
Sequence-IndependentSinglePrimerAmplification(SISPA)、VirusDiscoverycDNAAFLP(VIDISCA)、RandomPCR(rPCR)、RepresentationalDifferenceAnalysis(RDA)、DifferentialDisplay、全基因体外扩增(WholeGenomeAmplification)、RNA扩增(RNAAmplification)。
4.3.dsRNA技术(双链RNA分析技术)
在植物体内存在dsRNA(RNA病毒、类病毒等在寄主体内形成ssRNA的特异复制中间型),能够证明RNA病毒和类病毒因子的存在,因为植物本身不存在dsRNA。
在植物新病毒的鉴定中,某个病毒做为植物上新病原,或者检测一种植物上存在多种病毒复合侵染都可以通过dsRNA技术来鉴定[31,32];利用dsRNA技术还可以鉴别同一病毒内的株系或分离物;该技术还可用于病毒卫星RNA和亚基因组RNA的检测;用提取到的dsRNA为模板,还可进行病毒的分子克隆和抗血清制备,大大减少提取植物总RNA或病毒RNA的麻烦,简化程序;但是此技术不能用于DNA病毒的检测。
莴苣巨脉病毒和莴苣小斑驳病毒就可以用dsRNA技术来鉴定检测[33,34]。
4.4.芯片技术检测法
芯片技术在植物病毒鉴定检测中主要可用到的是基因芯片技术和蛋白质芯片技术。
其中基因芯片技术是DNA杂交技术与荧光标记技术相结合的基因水平检测方法,具有灵敏度高和可靠性强的特点。
其原理是将各种病毒样品的基因片段或特征基因片段点样,制成基因芯片,并以荧光标记的待检核酸与芯片进行杂交,杂交信号借助激光共聚焦显微扫描技术进行实时、灵敏、准确的检测和分析,最后通过计算机分析结果。
蛋白芯片技术,可以直接测量生物分子的特异性结合所形成的生物分子复合物,并不需要象酶联免疫或放射免疫法那样对生物分子作标记,不会对待测生物分子活性造成任何扰动和损伤;实时检测生物分子相互作用的动态过程。
在此基础上,还发展出了基质辅助激光解吸离子飞行等质谱技术(MALDI-TOF-MS)。
5.电化学阻抗光谱法(ElectrochemicalImpedanceSpectroscopy)[35]
基于电化学阻抗光谱对病毒特殊“信号”(“共振”频率)的识别的原理,可使用微流控芯片装置可对病毒进行鉴定检测和浓度定量。
有两种方法,第一种方法是基于微型装置显化识别所谓“共振”频率以及监控病毒的浓度变化,第二个方法则是依赖于测量在“共振”频率阻抗亲缘关系的变化。
在最高“共振”频率80赫兹时获得了病毒的影响象征,这是一个在测定纯化病毒稀释浓度上比传统的斑块鉴定浓度的估量方法更简单,因为它是建立在频率测量的基础上,所以在精确度测量上有更高的潜力。
植物病毒检测在植物病毒研究中有着非常重要的意义。
采用什么方法要根据病毒的种类、实际的设备条件、现有的技术掌握程度等。
生物学鉴定方法比较直接和直观,容易获得相应毒源,鉴定成本较低,但人工接种鉴定需要一定的时间,且不同的病毒感染寄主可能产生类似的症状,需要积累一定的症状辨别经验和严谨认真的观察态度。
电子显微镜技术可直接观察到病毒粒子的形态特征,即使现在鉴定技术进入了分子水平,电镜仍有其不可替代的作用。
但电镜操作需要一定的技术技能,设备成本昂贵,而且工作比较集中,不易对大量样本进行处理。
血清学技术简便、易操作,检测时间短,可同时检测多个样品,适合大部分实验室操作,是目前病毒鉴定方法中最为常用的方法。
血清学方法中常用的ELISA方法,灵敏度高、特异性强,克服了常规血清学方法受病毒浓度、粒体形态和抗血清用量等限制的缺点。
但ELISA检测的灵敏度和准确性受抗体的效价和特异性影响较大。
基因工程技术的兴起给病毒的检测手段带来了新的飞跃,检测水平已经达到微克水平。
其灵敏度和特异性是任何生化方法的检测所不能比拟的,同时可以省略大量的病毒提纯和血清的制备工作。
但分子生物学方法也有其局限性,如PCR反应绝大部分只能利用病原物的核酸或纯培养物作为模板,若以受侵染植物组织的核酸粗提液或材料浸泡液作为模板,PCR反应将会受到严重抑制;另外,一些尖端的PCR技术方法还需要特配的仪器。
随着现代科学技术的发展,植物病毒的鉴定和检测只会越来越精确简便。
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