18学时微生物实验讲义余1.docx
- 文档编号:12812020
- 上传时间:2023-06-08
- 格式:DOCX
- 页数:29
- 大小:403.71KB
18学时微生物实验讲义余1.docx
《18学时微生物实验讲义余1.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《18学时微生物实验讲义余1.docx(29页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
18学时微生物实验讲义余1
微生物学实验
(茶学、应用化学等专业共用)
任课教师:
余文英
教学时数:
18学时
实验周数:
4周
生物学实验教学中心—微生物实验室
微生物实验目录(18学时)
实验一:
培养基的配制及高压蒸汽灭菌(第一周)
实验二:
土壤自生固氮菌的分离纯化(第二、三周)
实验三:
稀释平板计数法(第二、三周)
实验四:
微生物的显微直接计数法(血球计数板)(第二周)
实验五:
细菌的简单染色与革兰氏染色(第三周)
实验六:
黑曲霉水浸片的制备与观察(第四周)
微生物学实验规则和安全
普通微生物学实验课的目的是:
训练学生掌握微生物学最基本的操作技能,了解微生物
学的基本知识,加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。
同时,通过实验,培养学生观察、
思考、提出问题、分析问题和解决问题的能力,实事求是、严肃认真的科学态度以及敢于创
新的开拓精神;树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。
微生物学实验室是一个严肃的实验场所,虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌,但许多微生物是否具有致病性不是绝对的,与其数量、条件、感染途径等有关,所以在实验操作中,必须将所有的微生物培养物都看成是具有潜在致病性的。
为了上好微生物学实验课,并保证安全,特制定如下规则和安全措施:
1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习,以了解实验的目的、原理和方法,做到心中
有数,思路清楚。
2.在整个实验过程中必须穿上实验服,留长发者,必须将长发挽在背后。
实验台上除了记
录本和笔(记录笔和记号笔)以外,不准堆放任何个人物品。
3.认真及时做好实验记录,对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验,则需记下每次
观察的现象和结果,以便分析。
4.实验室内应保持整洁,勿高声谈话和随便走动,保持室内安静。
5.实验时小心仔细,全部操作应严格按照操作规程进行,禁止用嘴吸取菌液或试剂,万一
遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤等意外情况发生时,应立即报告指导教师,及时处理,
切勿隐瞒。
6.实验过程中,切勿使乙醇(酒精)乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。
如遇火险,应先关掉火源,再用湿布或沙土掩盖灭火。
必要时用灭火器。
7.使用显微镜或其他贵重仪器时,要求细心操作,特别爱护。
显微镜的目镜在使用前后必
须用浸有乙醇(酒精)的透镜纸擦净。
对消耗材料和药品等要力求节约,用毕后仍放回原处,
严禁将药匙交叉使用。
8.每次实验完毕后,必须把所用仪器抹净放妥,将实验室收拾整齐,擦净桌面,如有菌液
污染桌面或其他地方时,可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖半小时后擦去,如系芽孢杆菌,应适当延长消毒时间。
凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。
9.每次实验需进行培养的材料,应标明自己的组别及处理方法,放于教师指定的地点进行培养。
实验室中的菌种和物品等,未经教师许可,不得携出室外。
10.每次实验的结果,应以实事求是的科学态度填入报告表格中,力求简明准确,认真回答
思考题,并及时汇交教师批阅。
11.离开实验室前将手洗净,注意关闭门窗、灯、火、煤气等。
实验一培养基的配制及高压灭菌技术
一、实验目的
1.学会一般培养基的制备原理、方法。
2.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。
3.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。
二、实验原理
培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质用人工方法配制而成的机制。
其中含有水分、碳水化合物、含氮化合物、无机盐及各种必要的维生素。
培养基可以为微生物的生长提供能源、组成菌体细胞的原理及调节代谢活动。
由于不同微生物的营养类型不同,对营养物质的要求也各不相同,因此,需要配制不同种类的培养基。
一般培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基,培养放线菌常用淀粉培养基,培养霉菌常用马铃薯培养基,培养酵母常用麦芽汁培养基。
培养基除了要满足微生物生长所需要的各种营养物质外,还应保证微生物所需要的其他生活条件,如适宜的酸碱度、渗透压等,因此,根据不同种类微生物的要求,应将培养基调节到一定的pH范围,如细菌培养基中性偏碱,放线菌培养基偏碱,霉菌、酵母菌培养基偏酸。
根据研究的不同,可以将培养基制成固体、半固体和液体三种形式,固体培养基的成分与液体相同,仅在液体培养基中加入凝固剂作为支持物,通常加入1.5%-2%的琼脂,半固体加入0.3%-0.5%琼脂作为支持物,有时也可以用明胶或是硅胶作为凝固剂。
三、实验材料(以牛肉膏蛋白胨培养基为例)
(1)溶液和试剂牛肉膏,蛋白胨,NaCl,琼脂,1mol/LnaOH,1mol/LHCl。
(2)仪器或其他用具试管,三角瓶,烧杯,量筒,玻棒,培养基分装器,天平,牛角匙,高压蒸气灭菌锅,pH试纸(pH5.5~9.0),棉花,牛皮纸,记号笔,麻绳/皮筋,纱布等。
四、操作步骤
(1)称量:
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏,蛋白胨,NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯。
蛋白胨很易吸湿,在称取时动作要迅速。
(2)溶化:
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热,或在磁力搅拌器上加热溶解。
将药品完全溶解后,补充水到所需要的总体积,如果配制固体培养基时,将称好的琼脂放入已溶的药品中,再加热溶化,最后补足所损失的水分。
在制备用三角瓶盛固体培养基时,一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中,然后按1.5%~2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中,不必加热溶化,而是灭菌和加热溶化同时进行,节省时间。
在琼脂溶化过程中,应控制火力,以免培养基因沸腾而溢出容器。
同时,需不断地搅拌,以防琼脂培糊底烧焦。
配制培养基时,不可用铜或铁锅加热溶化,以免离子进入培养基中。
(3)调pH
在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。
反之,用1mol/LHCl进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物,其pH的调节可用酸度计进行。
pH不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
配制pH低的琼脂培养基时,若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌,则琼脂因水解而不能凝固。
(4)过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利某些实验结果的观察。
一般无特殊要求的情况下,这一步可以省去。
(5)分装(如图1.1)
按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶中。
1液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
分装三角瓶的量则根据需要而定,一般以不超过三角瓶容积的一半为宜,如果是用于振荡培养用,则根据通气量的要求酌情减少;有的液体培养基在灭菌后,需要补加一定量的其他无菌成分,如抗生素等,则装量一定要准确。
图1.1分装培养基图示及将试管包扎成捆
2固体分装分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面。
分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
3半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝。
分装过程中,注意不要使培养基沾在管(瓶)口上,以免沾污棉塞而引起污染。
(6)加塞
①包扎:
加塞后,将全部试管用麻绳/皮筋捆好,再外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿塞,其外再用一道麻绳/皮筋扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
(有条件的实验室,可用市售的铝箔代替牛皮纸,省去用绳扎,而且效果好。
)
2灭菌:
将上述培养基以0.103Mpa,121℃,20min高压蒸气灭菌。
a)搁置斜面(如图1.2):
将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多),将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
图1.2斜面的摆法
b)无菌检查:
将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24~28h,以检查灭菌是否彻底。
阿斯毕无氮培养基
甘露醇(或蔗糖、葡萄糖)10g
KH2PO40.2g
MgSO4.7H2O0.2g
NaCl0.2g
CaSO4.2H2O0.1g
CaCO35g
琼脂20g
水1000ml
PH7.0~7.2
121℃灭菌20分钟
PDA培养基
马铃薯培养基(PDA):
葡萄糖20g
马铃薯200g
将马铃薯削皮,切成1*1厘米的丁块,加水煮到水沸腾20min,纱布过滤留取汁液,将汁液加入培养基中即可。
琼脂20g
水1000ml
PH自然
121℃灭菌20分钟
五、思考题:
(1)写出你所制备的培养基的配方,并分析其中所含物质对微生物生命活动所起的作用。
(2)培养微生物能否用同一种培养基?
细菌、放线菌、霉菌的培养基有何异同?
(3)培养基为什么要调节pH值?
所有微生物培养基最适pH值是否相同?
附:
高压蒸汽灭菌
一、原理
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高,得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三:
一是湿热中细菌菌体吸收水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低,二是湿热的穿透力比干热大;三是湿热的蒸汽有潜热存在,每1克水在100℃时,由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。
这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种,其构造如图。
本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。
二、操作步骤
1.首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。
2.放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3.加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。
4.用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。
当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。
本实验用1.05kg/cm2,121.3℃,20分钟灭菌。
5.灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。
如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。
6.将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时,经检查若无杂菌生长,即可待用。
三、思考题:
(1)高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽?
(2)灭菌完毕后,为什么要待压力降到0时才能打开排气阀,开盖取物?
(3)如何检查灭菌后的培养基是无菌的?
实验二土壤自生固氮菌的分离和纯化
一、实验目的:
1、学习微生物的纯系分离、培养方法;
2、掌握稀释分离、划线分离、涂抹分离纯化微生物的方法。
二、基本原理:
为了生产和科学的需要,往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种,这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物分离。
为了获得某种微生物的纯培养,可采用下列两种方法:
一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
如要从土壤中分离自生固氮菌,则培养基中是不能含有N源,这种培养基就比较适合能利用空气中N2的微生物。
另一种方法是在培养基中加入某种化学物质,以抑制人们不需要的微生物的生长繁殖。
分离土壤中的真菌,往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红、链霉素和金霉素等化学药品,目的在于抑制细菌的生长,这样更有利于获得纯培养。
土壤中微生物数量众多,在肥沃土壤中固氮菌数量也很多,自然界中多数氮素养料是有微生物固氮的结果,固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。
要分离自生固氮菌,常用阿斯毕无氮培养基这种选择性培养基,控制其适宜的环境条件,使它在培养基上大量繁殖,然后通过稀释法或划线分离法,使它在培养基上形成单菌落,若分离得不纯,需要进一步纯化,直到得到纯种。
三、实验材料
1、培养基:
阿斯毕(Ashby)无氮培养基
2、菜园土(各小组独立采样,并记录采样地点)
3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种环、酒精灯等。
四、方法与步骤:
(一)富集培养:
1、用已灭菌后冷却至50℃左右的阿斯毕培养基倒平板。
2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆入已冷凝的平板培养基上。
3、正面放置培养箱中培养,28℃培养3-4天后,在土粒周围有浑浊半透明的胶状菌落出现,有的在后期会产生褐色的色素。
(二)划线分离纯化:
1、用已溶化至50℃的阿斯毕培养基倒平板;
2、用接种环挑取上述菌落少许,在冷凝平板上进行划线分离,而后置于28℃培养4天。
划线方法如图:
A:
交叉划线法(1、2、3、4为依次划线的起点)
B:
连续划线法(1、2为依次划线的起点)
(三)纯化、镜检,得到纯种培养
1、平板上出现单菌落,按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中,28℃培养4天,即获得纯培养菌,可冷冻保存,备用;
2、镜检:
将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。
如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大,常呈单个或“8”字排列,在细胞表面有较厚的荚膜者,即为自生固氮菌。
若有杂菌,需要进一步划线纯化。
注意事项:
1)微生物分离、纯化这一操作环节,要严格按照无菌操作进行。
2)平板划线时,划线部位不可重叠;
3)划线时,每次都要将接种环上多余菌体烧掉。
实验三稀释平板测数法
一、实验目的
了解稀释平板计数的原理,学会将混杂的各种微生物分离成纯种,掌握统计分析样品中微生物的种类和数量的方法。
二、实验原理
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落,即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法,即一个菌落代表一个单细胞。
计数时,首先将待测样品制成均匀的系列稀释液,尽量使样品中的微生物细胞分散开,使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞),再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的含菌数。
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数,故又称活菌计数。
一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
三、实验器材
1.材料:
湖水。
2.培养基:
LB培养基
3.器材:
90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌枪头、电子天平、称量纸、记号笔、涂布棒、接种环等。
四、实验方法
1.样品稀释液的制备准确量取待测样品lg,放入装有9ml无菌水,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置20-30s,即成10-1稀释液;再用1ml无菌吸管,吸取10-1稀释液lml,移入装有9ml无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml,移入装有9ml无菌水的试管中,也吹吸三次,即成l0-3稀释液;以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀释菌液。
图4.1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养
用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低。
通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用l0-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度。
因为土壤中
2.平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法(选一种做即可)。
(以普通细菌为例)
(1)混合平板培养法 将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中,同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中,再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中(由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换)。
然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基,轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷凝后倒置,适温培养。
至长出菌落后即可计数。
(2)涂抹平板计数法 涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.2ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。
再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。
在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲。
将涂抹好的平板平放于桌上20—30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养(细菌32-37℃,真菌22-28℃,放线菌28-37℃),至长出菌落后即可计数。
3.挑取单菌落移接到相应的斜面培养基上划线,37℃培养3-4天,即获得纯培养菌,可冷冻保存,备用。
五、实验结果
将实验结果填入下表中
稀释度
10-4
10-5
10-6
10-7
菌落数
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1g样品活菌数
计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克土壤中的含菌数。
(1)同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。
(2)细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜,霉菌以每皿10—100个菌落为宜。
选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算。
混合平板计数法:
每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数
涂抹平板计效法:
每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数
六、思考题:
(1)培养微生物时,为什么要把已接种的培养皿倒置保温?
(2)分离微生物的目的是什么?
用稀释分离法,怎样保证准确并防止污染?
实验四细菌的简单染色与革兰氏(Gram,s)染色
一、实验目的
1、学习微生物的涂片染色的操作技术;
2、掌握微生物的简单染色、革兰氏染色的基本原理和方法。
二、实验原理
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。
酸性染料的离子带负电荷,能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物又称复合染料,如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态,简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。
二、实验材料
1﹑菌种:
大肠杆菌(Escherichiacoli)
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)
2﹑染液
①简单染色:
石炭酸复红染液
②革兰氏染色:
草酸铵结晶紫染色液﹑卢戈氏(Lugol)碘液﹑95%乙醇﹑番红复染液
3、用具:
显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、载玻片、擦镜纸、镊子、染色缸、打火机、洗瓶等
三、操作步骤
(一)﹑制片
①涂片取干净的载玻片,在载玻片中央滴加一滴无菌水,以无菌操作(见图1)取少许菌苔,在玻片的水滴中涂布均匀,成一薄层。
②风干在空气中自然干燥,切勿在火焰上烘烤。
③固定将已干燥的涂片向上,在微火上迅速通过2-3次,使得菌体与玻片牢固结合。
图1细菌染色标本制作及简单染色过程
(二)、染色
(1)简单染色:
在已制好的涂片菌膜处,滴加石炭酸复红染液染色1-2min,以流水冲洗涂片至水无色为止,后用滤纸吸干涂片的水滴,干后,待镜检(见图1)。
(2)革兰氏染色
①涂片
A、混合涂片法:
取一洁净载玻片,滴一小滴蒸馏水于玻片中央。
按无菌操作要求,先用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌培养物于玻片中央水滴中,涂布均匀。
接种环经灼烧灭菌冷却后,再挑取少量大肠杆菌培养物,混涂于玻片中央枯草芽孢杆菌菌液中,制成混合涂片。
要求涂片薄而均匀。
B﹑三区涂片法:
在一洁净载玻片近两端各滴一小滴蒸馏水,按无菌操作要求,先用接种环取少量枯草芽孢杆菌培养物于玻片左侧水滴中,涂匀后用接种环顺势向玻片中央拉移(注意不要接触右侧水滴)。
接种环经灼烧灭菌冷却后,再取少量大肠杆菌培养物混于玻片右侧水滴中涂布,涂匀后用接种环再顺势拉向玻片中央,与枯草芽孢杆菌菌液混合。
然后,在玻片中央用接种环再进行涂布,使两种菌互相混合。
②干燥﹑固定
涂片干燥后,快速通过火焰2~3次,进行固定。
固定时不可过热,以载玻片不烫手为宜。
③染色
A初染:
滴加结晶紫染色液覆盖玻片涂布区,染色1分钟,用水冲洗。
B媒染:
滴加路戈氏碘液冲去残水,并覆盖1分钟,水洗。
C脱色:
甩净载玻片上水分,倾斜玻片,并衬以白纸,用95%乙醇滴洗至无紫色褪下为止,时间20~30秒钟。
立即用水缓缓冲洗。
注意脱色时间不可过长,以免呈现假阴性。
D复染:
滴加番红染色液,染色3~5分钟,水洗。
④镜检
干燥后,置油镜观察。
革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
观察时以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌常常呈假阳性。
(五)实验完毕后的处理:
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净:
a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去;
b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次;
c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。
注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 18 学时 微生物 实验 讲义